人皮肤鳞状细胞癌的细胞原代培养研究方法

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1、人皮肤鳞状细胞癌的细胞原代培养研究方法王嘉月（山丙长治医学院附属和济医院病理科山丙长治046000）【摘要】目的探讨一种简便实用、成木低、纯度高并且成熟稳定的，体外培养人皮肤鳞状细胞癌癌细胞及建立原代细胞系的方法,为皮肤癌的研宄奠定实验基础。方法对20份皮肤鱗癌患者的新鲜手术标木，采用组织块培养法和胶原酶消化悬液培养法进行体外培养。通过直接观察、细胞形态学观察和免疫细胞化学方法观察细胞的生长情况、细胞形态学特征及鉴定所得到的癌细胞情况。结果3份标木两种方法均培养山皮肤癌细胞，后者培养的细胞牛.长速度快。结论应用组织块和胶原酶消化法培养食管癌细胞，方法可行，适合推广

2、应用。【关键词】皮肤鳞状上皮癌细胞细胞培养细胞系【中图分类号】R73-35+1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）20-0117-02皮肤鱗癌（SSCC）是起源于皮肤角朊细胞的一种恶性肿瘤，有时亦起源于附属器，包括毛囊漏斗、皮脂腺导管或末端汗腺的角朊细胞。SSCC在所有癌中占很大比重，Ackerman统计占全部癌肿的第一位，国内胡正祥等［1］统计其占第二位，我国各种皮肤癌发病率明显不同于丙方国家，欧美统计皮肤癌中胞癌的比例约鱗癌占20%,而基底细胞癌占80%。我国与某些亚洲国家的情况正好相反，主要为鳞癌，鳞癌与基底细胞癌约为（5〜10）:1［

3、2］。SSCC的临床治疗以局部手术切除为主，辅以化疗，晚期肿瘤预后较差是因其发牛.深部浸润与远处转移。皮肤癌的发生机制始终是研宄的热点问题之一,但目前尚未完全阐明［3］。体外分离、培养皮肤鳞癌细胞并建立细胞系，是研究皮肤癌生物学特性、癌变机理、指导治疗及判断预后必要的生物学模型。但皮肤癌细胞系的建立比较困难,目前国内己建立的皮肤癌细胞系较少。多数方法或不稳定可靠，或步骤复杂所用试剂昂贵，严重制约了后续的研究工作。木研究结合国内外的一些培养方法，釆用传统的组织块法在含有低浓度血清的复合培养基中体外培养皮肤表皮细胞。以寻求一种适于推广的简便、快捷的方法，为体外进一步研

4、宄正常上皮细胞的恶性转化及治疗方面，提供可靠的细胞来源。1材料与方法1.1主要仪器和材料人皮肤鱗状细胞癌癌细胞取自长治医学院附属和平医院皮肤科，自2009年10月-2010年10月皮肤鱗癌的手术标本20例。试剂购自于中杉公司。1.2培养基制备1.3皮肤鱗状上皮的取材及分离培养以皮肤癌手术后3h以内的食管标本为材料。肉眼选取距肿瘤边缘3cm以外的大约2cm×3cm大小的皮肤组织，放入含有200U/ml青霉素、200mg/ml链霉素的1640培养基中，立即带冋实验室。每次取材后,所取皮肤标本均经病理证实为正常的皮肤鱗状上皮细胞，无不典型增生及肿瘤细胞。在无

5、菌条件下反复冲洗皮肤组织。置于1640培养基中,尽量剪除黏膜下血管和结缔组织，将黏膜剪成2mm2大小的组织块。在25ml培养瓶底部涂布胎牛血清，并且放入温箱中稍晾干，将剪好的黏膜贴于培养瓶内,黏膜面均朝上，每瓶9块,每个组织块间相隔1cm,然后加入少量DMEM与F12混合(1:1)培养基使组织块湿润，其后48h内将瓶中的培养基加到2ml。放入37°C、5%CO2的培养箱培养。以后每2〜3天换液一次。5天后开始有细胞从组织块边缘长出,14天后换液均去掉漂浮的组织块。每个组织块所长出的上皮晕直径可有2〜3cm,4〜5个组织块长出的细胞可以覆盖培养瓶底。以后将组织块迁移

6、到新的培养瓶中，按上述方法培养，组织块可以被连续迁移数次，每次均冇细胞长出，状态良好生长稳定。同时，使用1640培养基应用上述方法进行皮肤上皮细胞的原代培养，观察培养细胞生长情况和状态。1.4细胞学观察及鉴定当冇细胞从组织块边缘爬出后,以倒置相差显微镜观察活细胞形态，盖玻片制作细胞爬片，常规HE染色,普通光学显微镜下观察细胞形态。透射电子显微镜观察细胞超微结构。免疫组化方法鉴定细胞分子标记，使用角蛋白(CK)多克隆抗体,按免疫组化试剂盒说明进行，普通光学显微镜下观察CK蛋白在细胞中的表达情况,胞浆棕黄色表明细胞角蛋白阳性。1.5细胞活力检测活细胞直接观察、细胞计数

7、法绘制细胞生长曲线、锥虫蓝活力鉴定参照文献［4】。2细胞学观察结果2.1细胞培养情况细胞培养情况组织块培养法:组织块接种后第2天周边开始出现圆形透亮的细胞，第7天开始周边爬出上皮细胞贴壁生长，第10天开始上皮晕逐渐向外周扩大，细胞单层紧密镶嵌排列，呈多角形，到第20天上皮晕融合成片，给予首次传代。此后每4〜6天传代1次。胶原酶消化法:悬液接种后第2天大部分细胞已贴壁，细胞聚集成闭散在分布，第5天细胞闭块周边开始爬出细胞,形成上皮晕后细胞紧密镶嵌排列，第14天细胞生长融合给予首次传代,此后每3〜5天传代1次。2.2细胞形态学观察及鉴定倒置相差显微镜下观察，细胞主要呈

8、多角形，人