《犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测.doc

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1、《犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法》河南省地方标准编制说明犬瘟热（Caninedistemper，CD）是世界范围内广泛发生的一种犬的急性、高接触性传染病，其病原为犬瘟热病毒（CDV），于1905年首次报道，其自然宿主包括大部分的食肉目动物。该病传染性强，易继发细菌和其他病毒的混合感染或继发感染，发病率高达80%，康复后易出现麻痹、抽搐、癫痫样发作等后遗症。该病无特效药物治疗，成为危害养犬业的主要疫病之一。CDV属于副粘病毒科麻疹病毒属、负链单股不分节的RNA病毒，基因组全长为15616bp。病毒的蛋白主要有核衣壳

2、蛋白(Nucleocapsidprotein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质膜蛋白(Matrixprotein,M)、融合蛋白(Fusionprotein,F)、附着或血凝蛋白(AttachmentproteinorHemagglutininprotein,H)、大蛋白(thelargevirusspecificiedRNAdirectedRNApolymeraseprotein,L)6种，编码基因在基因组的位置从它的3'端到5'端依次为3c端前导序列、N、P、M、F、H和L基因以及5c端前导序列，其中H蛋白是CDV与细

3、胞受体结合的蛋白，并决定着病毒感染的细胞嗜性，H蛋白基因常作为诊断检测所用的靶基因。犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canineparvovirus，CPV）引起犬的一种急性接触性传染病，病犬主要以剧烈呕吐、出血性肠炎、严重脱水、白细胞减少和心肌炎等为主要特征，犬细小病毒于1978年从患有肠炎的病犬体内首次分离获得，幼犬对CPV的易感性较高，并可以发生心肌炎。发病率高达50%~100%，病死率为10%~50%，对养犬业、犬科经济动物养殖和犬科野生动物危害巨大。CPV是细小病毒科、细小病毒属成员，具有细小病毒属病毒典型形态和结构。基因组为单股DNA，

4、病毒粒子有VP1、VP2和VP3三种多肽，其中VP2为衣壳蛋白主要成分，为主要抗原基因，常作为检测CPV的主要靶基因。临床上CDV、CPV多混合感染，是当前严重危害犬、猫健康的主要疫病，防控难度大，对养犬业危害严重，每年均造成巨大的经济损失。由于二者引起的临床症状相似，单凭临床症状和剖检病变难以确诊，因此必须借助实验室检测进行确诊。目前已有的CDV/CPV的检测方法主要有病毒分离鉴定、免疫荧光法(IF)、免疫组织化学技术(IHT)、免疫电镜法(IEM)、血凝/血凝抑制试验（HA/HI）、中和试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，这些方法存

5、在操作繁琐、技术要求和试验条件要求高、试验周期长等缺点，难以满足快速、大量检测的需要，并且是针对某一种病毒的单一PCR或FQ-PCR检测方法。因此急需建立一种快速、高效、特异、敏感的检测方法，且同时对CDV和CPV两种病毒核酸进行快速鉴别检测。2013年5月，农业部下发了《关于进一步加强犬和猫产地检疫监管工作的通知》（农医发〔2013〕16号），要求对所有跨省调运的犬、猫进行CDV、CPV实验室病原学检测，实验室检测结果作为出具检疫证明和是否许可调运的重要依据。单就河南省而言，每年需要对CDV、CPV检测量至少在5000万头份以上，这要求实验室

6、必须对CDV、CPV进行快速、准确、大量检测。目前国内外已报道的CDV、CPV病原学快速检测方法有针对该病原的单一PCR或FQ-PCR检测方法，但未见有针对CDVH基因和CPVVP2基因设计了特异性引物对和TaqManMGB探针建立CDV/CPV荧光定量PCR方法。本标准所建立的犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法反应可在1h～2h内完成，减少了电泳环节的时间和污染，TaqManMGB探针能区分目的基因中1个碱基的差别，因此该方法具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速诊断CDV、CPV的要求，对及早快速

7、确诊CDV、CPV病，有效防控疫病的发生，防止病原传播扩散，维护养犬业、经济动物养殖业和宠物养殖的健康发展，保障公共卫生安全和社会稳定，保护宠物饲养者权益等具有重要意义。该技术标准具有实用性和可操作性，若采纳、颁布实行后，将为我省CDV、CPV的临床快速确诊和跨省调运工作提供技术保障。一、工作简况，包括任务来源、起草单位、主要工作过程、主要起草人及其所做的工作：1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2016年第一批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫质监标发〔2016〕127号）的要求，由河南省动物疫病预防控制中

8、心负责对河南省地方标准《犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法》的起草、制定工作。2、起草单位：河南省动物疫病预防控制中心。3