菊花转录因子cmtgas的克隆及同源遗传转化分析

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1、摘要菊花(Chrysanthemummorifo以“mRarnat．)是原产我国的传统花卉，集观赏、药用、食用于一体。在生产实践中，病害成为影响其产量和品质的重要因素，黑斑病是主要病害之一。水杨酸(SA)介导的系统获得抗性(SAR)能使植物获得对病原的广谱抗性，转录因子TGA在SA介导的SAR中起重要的调节作用。本研究以原产河南省焦作市怀区的优良品种小黄菊(Huaiqingyellowchrysanthemum)为试材，对其SAR调节基因CmTGAs进行了系统研究，并对其黑斑病原菌进行了分离纯化，取得了如下研究结果：1．分离到三个CmTGAs类基因全长，分别为CmTGAl、CmTGA5、

2、CmPAN。采用Race法克隆到CmTGAl、CmTGA5、CmPAN三个基因，与已知基因序列进行同源性比对，同源性分别可达到61％，80％，65％，通过对编码区氨基酸序列进行分析发现，亮氨酸拉链保守区分别在N端第70一100、40—80、150—195个氨基酸，D亚族特征序列分别位于N端第340--351、309--321、420--430个氨基酸。2．构建了CmTGAs的过表达载体、获得了转化菌株。利用酶切、连接的方法构建了转基因载体superl300．GFP—CmTGAs，通过冻融法将superl300．GFP．CmTGAs导入农杆菌GV3101中。3．建立了小黄菊的胚状体高频再生

3、及受体再生体系。最佳胚状体诱导培养基组合为MS+1．5mg／LIAA+0．5metE6-BA+1．0merlE2,4一D，最适诱导时间为10d，诱导率可达80％，诱导后在去除2，4．D的分化培养基上，芽的分化率可达75％。以此为基础，进一步优化了受体再生体系，确定以5．0mg／L潮霉素(HmB)为芽分化选择压、4．5mg／L潮霉素为生根选择压、头孢霉素(Ce￡)最适抑菌浓度为100mg／L。4．进行了CmTGAl的同源转化，获得了抗性植株。将小黄菊叶块在IM诱导培养基上预培养3d，用摇至OD600=0．5．0．7工程菌侵染10min，黑暗共培养2d，在含100mg／LCeil和1．0mg

4、／LHmB的IM上，诱导5d转接到含100mg／LCef和5．0mg／LHmB的RM分生培养基筛选培养，待愈伤组织分化出不定芽后转到含100mg／LCef．和10．0mg／LHmBDM发育培养基上生长两周左右，转到含50m∥LCef．和4．5mg／LHmBRTM生根培养基中进行生根筛选培养。共获得抗性植株23株，18株具有明显绿色荧光蛋白。5．利用组织分离纯化法分离得到两个小黄菊黑斑病病原菌菌株A1和A2。用组织分离法共获得3个菌株，柯赫氏法则鉴定其中2个菌株为黑斑病致病菌；通过形态观察和产孢表型观察判断A1和A2均为链格孢属真菌；通过ITS序列进化树分析，证实了为菊花黑斑病病原菌，为转

5、化植株的抗病性生物学检测提供了病原基础。关键词：小黄菊，CmTGAs基因，胚状体途径，克隆，遗传转化，黑斑病病原菌ABSTRACTChrysanthemummorifoliumRamat．isatraditionalfloweroriginatedfromChina．Theseflowerscanbeusedasornamental，medicinalandedibleplants．Inproductivepractice，avarietyofdiseasesarethemajorbiologicalstressfactorsinlimitingyieldandquality．Black

6、spotdiseaseofChrysanthemumisoneofmajordiseases．Systemicacquiredresistance(SAR)mediatedbysalicylicacid(SA)canmakeplantsobtainedthebroadspectrumresistanceagainstpathogens．TGAtranscriptionfactorplaysanimportantroleinSA-mediatedSAR．Inthisstudy,asagoodqualitycultivar,Huaiqingyellowchrysanthemum，whichi

7、sfromHenanprovinceJiaozuocityHuairegion，isusedaSexperimentmaterials。itsCmTGAswereclonedandtransferred，atthesametime，andpathogenofblackspotdiseasewasisolatedfromHuaiqingyellowchrysanthemum．Theresultsobtainedareasfollows