保护酶活性测定方法.doc

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1、保护酶活性测定方法一、过氧化物酶（POD）活性测定1、酶液的制备：称取样品3g，加入预冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。2、试剂：0.05mol/LpH5.5磷酸缓冲液0.05mol/L愈创木酚溶液（2-甲基酚）20%三氯乙酸溶液2%H2O23、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、过氧化物酶活性测定：（1）加入反应混合液2.9ml磷酸缓冲液1ml愈创木酚溶液（2-甲基酚）1mlH2O20.1ml酶液（2

2、）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并加入2ml三氯乙酸溶液终止反应（3）过滤，适当稀释。在470nm处测OD470。5、结果计算：以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。即酶活力=OD×D/0.01t酶的比活力=OD×D/（0.01tw）其中：OD为反应时间内吸光度的变化W为材料鲜重t为反应时间D为稀释倍数。即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数二、多酚氧化酶（PPO）活性测定1、酶液的制备：称取样品3g，加入预冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15mi

3、n,取上清夜置于低温冰箱备用。2、试剂：0.05mol/LpH5.5磷酸缓冲液0.05mol/L儿茶酚溶液（邻苯二酚）20%三氯乙酸溶液2%H2O23、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、多酚氧化酶活性测定：（1）加入反应混合液3.9ml磷酸缓冲液1ml儿茶酚溶液0.1ml酶液（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并立即加入2ml三氯乙酸溶液终止反应。（3）过滤，适当稀释。在525nm处测OD525。（4）结果计算：以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。即酶活力=OD×D/0.01t酶的比活力=OD×D/（0.

4、01tw）其中：OD为反应时间内吸光度的变化W为材料鲜重t为反应时间D为稀释倍数。即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数三、超氧物歧化酶（SOD）活性测定1、酶液的制备：称取样品3g，加入预冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。2、试剂：14.5mmol/L甲硫氨酸溶液（A）3×10-3mmol/L乙二胺四乙酸（B）2.25mmol/L氯化硝基四氮唑蓝（C）60×10-3mol/L核黄素（D）0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液3、

5、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、超氧物歧化酶活性测定：（1）加入反应混合液甲硫氨酸溶液（A）3ml乙二胺四乙酸（B）2ml氯化硝基四氮唑蓝（C）2ml核黄素（D）2ml（2）在盛有反应混合液3ml的试管中，加入0.1ml酶液，混合后放在透明的试管架上，在25℃生化培养箱中，光照15min，并立即遮上黑布终止反应。（3）过滤，适当稀释。在560nm处测OD560。（4）结果计算：以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。即酶活力=OD×D/0.01t酶的比活力=OD×D/（0.01tw）其中：OD为反应时间内吸光度的变化W为

6、材料鲜重t为反应时间D为稀释倍数。即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数四、苯丙氨酸解胺酶（PAL）活性测定1、酶液的制备：称取样品3g，加入预冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至50ml，低温离心（10×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。2、试剂：0.05mol/LTris-H2SO4缓冲液（pH8.8）：称取Tris6.057g溶于水中，用H2SO4调节pH值至8.8，用水定容至1L。0.02mol/L苯丙氨酸溶液：称取3.3038g苯丙氨酸，溶于1L的0.05mol/LTris-H2SO

7、4缓冲液（pH8.8）。PAL酶提取液：称取Tris12.114g,EDTA-Na0.3722g,甘油76.2g，巯基乙醇0.52ml，溶于水中，用H2SO4调节pH值至8.3，用水定容至1L。3、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、苯丙氨酸解氨酶活性测定：（1）加入反应混合液试剂苯丙氨酸溶液Tris-H2SO4缓冲液（pH8.8）PAL酶液备注处理242对照62空白（调零用）26只需1管（2）30℃水浴锅中保温30min。（3）在290nm处测OD290。（4）结果计算：以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。即酶活力=O

8、D×D/0.01t酶的比活力=OD×D/（0.01tw）其中：OD为反应时间内吸