重组质粒地酶切鉴定和pcr实验

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1、重组质粒的酶切鉴定及PCR实验一、【实验目的】1、酶切鉴定重组质粒插入片段的大小；2、学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。二、【实验原理】1、PCR反应基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）

2、：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR反应原理图2、PCR反应体系与反应条件(1)标准的PCR反应体系10×扩

3、增缓冲液10μl4种dNTP混合物200μl引物10～100μl模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5μlMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水100μlPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。(2)PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位

4、于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物设计的基本原则①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。③引物内部不应出现互补序列。④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3′端的互补重叠。⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个

5、碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。⑦引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。(3)模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗

6、制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。(4)PCR反应条件的控制①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L③底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L④TaqDNA聚合酶2.5U(100ul）⑤引物浓度一般为0.1～0.5umol/L⑥反应温度和循环次数变性温度和时间95℃，30s退火温度和时间低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃延伸温度和时间72℃，1min/kb(10kb内）Tm值=4(G+C)+2(A+T

7、)循环次数：一般为25～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。3、PCR的循环参数(!)预变性（Initialdenaturation）模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。（2）循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以

8、使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。（3）引物退火（Primerannealing）退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PC