EGFP在肿瘤细胞中的表达调控基因工程综合性实验

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1、西南大学本科实验教学改革行动计划项目——综合性、设计性实验项目建设项目名称：EGFP在肿瘤细胞中的表达分析--基因工程课程综合性实验项目项目负责人：杨应斌负责人所在部门：生命科学学院填表日期：2010年6月16日.EGFP在肿瘤细胞中的表达分析引言利用肿瘤组织特异性启动子调控自杀基因在肿瘤组织的靶向表达，是肿瘤基因治疗研究中的一种策略。目前常用的肿瘤组织特异性启动子有：前列腺特异性抗原（PSA）启动子、癌胚抗原（CEA）启动子、人类端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子等。其中hTERT在85%以上的不同组织起源的各种类型的恶性肿瘤中，都可以检测到较高水平的表达

2、，而在正常哺乳动物体细胞中，除生殖细胞等少数几种细胞可检测到活性以外，其它组织细胞均为阴性。由于hTERT启动子和其它启动子相比，具有广谱（在大多数肿瘤细胞中有活性）、转录活性高、靶向性好等优点，因而被认为是肿瘤基因治疗领域里较有潜在应用价值的启动子。现已有使用hTERT启动子成功对骨肉瘤、结肠癌、肝细胞肝癌等恶性肿瘤进行靶向基因治疗的报道。人类骨髓干细胞不具有端粒酶活性已经被报道，然而BurnsJS的研究发现，长时间在体外培养的干细胞可能发生癌变，其原因是其开始表达端粒酶。而肿瘤细胞之所以能够无限增殖，也与其有比正常细胞活跃的端粒酶有关。hTERT基因的转

3、录机制严格控制着端粒酶的活性的表达，而hTERT基因的转录被hTERT基因启动子调控，hTERT基因启动子是一种在肿瘤细胞中特异启动的启动子，因此，我们构思可以利用hTERT基因启动子，在其下游接入自杀基因，并将其克隆入慢病毒载体中，再借助慢病毒将此融合基因导入骨髓干细胞中，筛选出含有由hTERT基因启动子控制自杀基因的供体骨髓干细胞，当这种移植的骨髓干细胞在植入体内后有形成肿瘤细胞的趋势时，就可以通过自杀基因的表达使用前体药物对有瘤变趋势的骨髓干细胞进行杀灭，这样既不会对受体产生副作用，又可以由此解决骨髓干细胞移植的安全性问题。因此构建一种靶向表达自杀基因

4、的载体，这种载体转染骨髓干细胞后能很容易筛选，并且被转染的骨髓干细胞能稳定表达自杀基因且不会发生丢失，这将成为骨髓干细胞移植瘤变研究中关键且必要的步骤。然而，在本研究的前期实验中，我们发现野生型hTERT启动子如其他已知肿瘤组织特异性启动子一样，仍然存在着肿瘤组织转录活性与靶向性较差的问题，而不能保证将导入体内的自杀基因限制在肿瘤细胞中特异性地表达。因此，如何利用肿瘤细胞中特异性的表达上调因子结合元件对hTERT启动子进行顺式修饰，以提高hTERT启动子在骨髓瘤变细胞中的转录活性是本节研究所关注的重点。据研究表明，c-Myc.基因的大量扩增是促使癌细胞无限增

5、殖的重要原因，转录因子c-Myc（或c-Myc与其它转录因子形成的二聚体复合物）与hTERT启动子上的E-box结合后可以启动hTERT基因的在肿瘤细胞中特异性表达，但在正常细胞中的表达较低甚至缺乏。通常情况下，在肿瘤细胞中c-Myc表达占优势，c-Myc转录因子（c-Myc或与Max蛋白形成异二聚体复合物）在识别和连接E-box后，激活hTERT基因转录；而在正常细胞中mad1表达占优势，mad1（或mad1和Max蛋白形成异二聚体复合物）和c-Myc竞争识别和连接E-box后，抑制hTERT基因转录。进一步的研究表明，在hTERT启动子核心序列上含有两个

6、E-box（5＇-CACGTG-3＇），分别位于hTERT基因起始密码子ATG上游-34和-242位置上.敲除-34位E-box，可使启动子活性下调10倍，与无启动子时的表达水平相似，但缺失或敲除-242bp位置处E-box时，hTERT启动子活性只是不同程度的下降。说明hTERT启动子核心序列3＇端位置的E-box保守序列对维持hTERT启动子功能具有更加重要的作用。因此，我们假设c-Myc转录因子与hTERT启动子上的结合元件（E-box）结合（特别是与hTERT启动子核心序列3＇端位置处的E-box保守序列结合）后可以上调hTERT的表达，那么增加hT

7、ERT启动子序列上E-box元件（特别是hTERT启动子３＇端的E-box元件）的数量后，势必会引起转录因子c-Myc（或c-Myc与其它转录因子形成的二聚体复合物）和转录抑制因子mad1（或mad1与其它转录因子形成的二聚体复合物）与hTERT启动子结合机会增加，最终导致hTERT启动子在肿瘤细胞中转录活性得到进一步的提高。材料准备1质粒、菌株和细胞质粒pLenti6/V5-D-TOPO(invitrogen)质粒pUC-ModhTERT　　　　　　　　　　　　（实验室自行化学法制备）质粒pUC-WThTERT（实验室自行化学法制备）质粒pGL3-basi

8、c　　　　　　　　　　　(Promega)大肠杆菌菌