《高新技术论文》word版

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1、随着生命科学和化学的不断发展，人们对生物体的认知已经逐渐深入到微观水平。从单个的生物体到器官到组织到细胞，再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平，人们意识到可以通过检测分子水平的线性结构（如核酸序列），来横向比较不同物种，同物种不同个体，同个体不同细胞或不同生理（病理）状态的差异。这就为生物学和医学的各个领域，提供了一个强有力的技术平台。目前，常用的分子生物学技术有如下几种[1]：PCR单链构象多态性分析PCR-单链构象多态性分析(PCR-singlestrandconformationanalysis,PCR-SSCP

2、)是近年来在基因突变检测中运用最广泛的方法之一。PCR-SSCP技术凭借突变可引起单链DNA三级构象改变,通过观察单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率漂移来判断突变。样品经PCR扩增后，其产物经变性后可以产生2条单链，如果存在基因突变，哪怕是一个碱基的异常，单链的构象也会发生变化，正常与突变的DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中，可以显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型，PCR-SSCP分析的主要优点是简易且敏感性较高。但是该技术不能确定突变的部位和性质。PCR-SSCP突变检测敏感性随PCR产物长

3、度的增加而降低，一般用于检测较小外显子的突变。有时由于单个核苷酸变化所引起的构象改变很小，用PAGE电泳就可能无法检出，在PCR产物或待测DNA小于200bp时，PCR-SSCP分析能够检测出70%~95%的突变。如果以毛细管电泳代替PAGE，则可大为提高突变检测的效率。Wallace1997年提出将PCR-SSCP和异源DNA双链分析（heteroduplexanalysis,HA)相结合，称之为SSCP/HA，部分PCR产物经变性进行SSCP分析以了解是否具有突变，其余PCR产物直接用于电泳，以检出含有突变的异源

4、DNA双链，电泳凝胶经银染，单链DNA所形成的带为橘黄或棕色，而双链DNA则表现为灰黑色。该综合手段可以单链构型多态性和异源双链构型分析两个不同的层次检出突变，是一种经济、迅速的突变检测手段，但无法提供突变位置的信息。PCR-SSCP有许多改进技术，如RNA单链构象多态性法（PCR-rSSCP）、双脱氧测序单链片段构象多态分析（PCR-ddF）、限制酶指纹技术(PCR-REF)等。PCR-rSSCP法依据RNA构象对单个碱基替代更敏感的原理，在PCR引物上加上某类启动子，通过转录的RNA构象体的电泳迁移差异进行突变鉴

5、别。PCR-ddF法把PCR产物转录，将转录物用反转录酶进行Sanger双脱氧终止测序反应，通过观察非变性胶上经解链处理所产生的单链漂移、突变后终止片段的获得与缺失来判断突变。PCR-REF法将RFLP和SSCP技术优势组合，将PCR扩增的待测片段用5~6种限制酶依次消化，混合并进行末端标记，最后经变性处理并在非变性凝胶上电泳分离，从而获得来自片段长度和片段构象的双重突变信息。变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)利用由碱基序列所决定的D

6、NA片段溶解度或变性度的差异，达到分离野生型与突变型DNA片段的目的，该手段分辨率达一个碱基。当DNA双链沿变性剂浓度梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶迁移时，DNA分子中解链温度（Tm)低的部分逐渐变性解链。一般总是错配碱基部分的异源双链Tm最低，最容易解链，其次是富含AT碱基对的部位，富含GC碱基对的部位Tm值较高所以解链较难。因此，正常DNA双链和异源双链在梯度变性胶中电泳时，异源双链总是先解链。将PCR产生的双链DNA在浓度递增的尿素和甲酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当某一DNA片段迁移到变性剂浓度与其最低Tm相当的位

7、置时，该片段低温解链部分的双链打开，部分解链导致DNA迁移速度明显下降，观察样品的迁移率变化即可判断是否存在变异。DGGE敏感性高，即便异源双链中仅含一个错配碱基，在电泳时也可分辨其迁移率的改变。DGGE方法的单碱基突变检出率在DNA片段长度600bp以内可以达到95%。DGGE的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置，相应的DNA片段可能全部解链，使试验无法检出存在于高TmDNA片段中的碱基替换。为了解决此问题，可以在一个PCR引物的5'端设计一段富含GC的尾巴

8、，从而使PCR扩增产物的一端富含GC碱基对，保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链，在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链，这一改进使DGGE的突变检出率接近100%，但DGGE只能检测突变是否存在而不能确定突变的位置。DGGE方法需要设计特定片段最佳的PCR引物以及最佳变性条件，这一过程比较复杂，梯度变性胶的制备需要的设备较昂