蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析

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1、第十章蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析氨基酸是组成肽和蛋白质的基本单位,也是生物体维持生长所必需的营养物质，它们参与机体的代谢过程，具有广泛的生物活性和特殊的生理功能。在对肽和蛋白质的结构和功能进行研究时，往往需要将其进行完全水解，测定其氨基酸的组成；生物体内游离氨基酸在神经信息传递、代谢的调节以及肽、蛋白质的合成等生理过程中起着重要作用，为了了解其生理功能及某些外源性刺激对其功能的影响，也需要对生物体液、细胞或组织内的游离氨基酸进行分析。除了氨基酸总量测定外，往往更需要对个别氨基酸进行分析。常用的氨基酸分析方

2、法可归纳为两类：衍生化间接分析法和无需衍生化的直接分析法。蛋白质的一级结构即蛋白质中多肽链中氨基酸的排列顺序，既是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础，又有助于蛋白质的基因结构的研究。在某些特定情况下，基因突变常常导致蛋白质中氨基酸的序列发生改变，从而引起功能失调和疾病产生。因此，测定蛋白质的氨基酸序列对新的诊断学方法开发、新的治疗方法建立以及多肽类药物的研究均有重要的意义。§10.1氨基酸的衍生化间接分析法无论是游离氨基酸还是水解氨基酸的测定，由于多数氨基酸都缺少结构检测特征，既无紫外吸收，又无荧光，必须使之衍生

3、，转化为具有紫外可见光吸收或能产生荧光的物质才能检测分析。§10.1.1氨基酸的衍生化反应为了使测定氨基酸的方法灵敏度高，分辨率好，氨基酸的衍生化是关键步骤之一。近年来人们致力于开发灵敏度高、衍生操作简单、形成的氨基酸衍生物稳定的衍生化试剂。常见的衍生化试剂有茚三酮、邻苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、异硫氢苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）等。茚三酮在酸性（pH=3~4）和加热条件下与氨基酸反应生成氨、二氧化碳和蓝－紫色的复合物（最大吸收波长为570nm）：(10.1)除了a-氨基

4、酸外，其它的氨基酸也可生成有色物质，但无二氧化碳生成，b-，g-，d-和e-氨基酸比a-氨基酸反应慢得多，生成的是蓝色物质，而亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应形成黄色化合物（最大吸收波长为440364nm）。氨基酸与茚三酮的反应主要用于柱后衍生，也可用于氨基酸的比色分析，是公认的氨基酸总量的定量方法。在定量分析时，必须除去对测定有干扰的蛋白质、氨和尿素。邻苯二甲醛（OPA）与巯基试剂，通常与b-巯基乙醇连用，在碱性条件下与第一级氨基酸迅速反应生成1－硫代－2－烷基异吲哚，加成物可产生荧光，在紫外区也有较强

5、的吸收，反应式如下：(10.2)该反应不仅适用于柱前衍生，也适用于柱后衍生，它既可进行高灵敏度的荧光检测（lex=340nm，lem=450nm），检测限达～molL-1，也可进行一般的紫外检测（最大吸收波长为230nm），检测限达5molL-1。紫外检测的线性范围为10~200pmol，荧光为0.8~15pmol，OPA本身不干扰分离和检测，不必除去过量试剂，色谱图基线也比较平稳。OPA法主要的缺点是：（1）亚氨基酸不能与其直接反应，需先氧化（如用次氯酸钠）开环后才能反应。（2）荧光产物不稳定。丹酰氯（Dans

6、yl-Cl）在碱性条件下与氨基酸反应生成强荧光物质，它同一级、二级氨基酸都能起反应，但是反应速率比较慢，在室温条件下需35min左右，反应产物的转化率与反应时间关系较大，反应温度升高可以加速产物转化，但最高不可超过60℃，否则Dansyl-Cl会发生水解，反而使产物转化率降低。(10.3)Dansyl-氨基酸在酸性条件下（pH=2~3）一般可被乙酸乙酯抽提，大量的Dansyl-Cl的反应副产物Dansyl-OH留在水相，干扰因素减小。但是Dansyl-精氨酸、Dansyl-天冬氨酸、Dansyl-谷氨酸、Dans

7、yl-丝氨酸和Dansyl-苏氨酸则大部分或部分留在水相，往往会被遗漏，而导致错误结论。Dansyl-Cl法的检测限与OPA法相当，线形范围一般在15~150pmol。优点是（1）衍生物比较稳定，一般可放置12~24h；（2）Dansyl-Cl胱氨酸衍生物线性关系好，可用于体液中胱氨酸的定量测定。缺点是（1）反应时间必须严格控制；（2）衍生物对紫外光照比较敏感，故反应要在避光条件下进行；（3）易生成多级衍生物，如赖氨酸、组氨酸、色氨酸生成二级衍生物。异硫氰苯酯（PITC）可以和一级、二级氨基酸反应，在室温条件下仅

8、十分钟即可完成，反应产物具有紫外吸收（最大吸收波长为254nm）。PITC的衍生物单一、稳定，-20℃364可贮存数月，4℃水溶液可保存3天;分析时间短,结果准确,紫外检测限可达1pmol。(10.4)PITC法最大的缺点就是氨基酸衍生时需要真空干燥以除去过量试剂。氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）能与一级、二级氨基酸的氨基反应，生成的衍生物可用荧光检测（lex=260nm，