pcr扩增电泳后没有条带,材料都没问题,那会是哪个操作出了问题

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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划pcr扩增电泳后没有条带,材料都没问题,那会是哪个操作出了问题　　聚合酶链式反应扩增DNA片段　　一、实验目的　　1．学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法。　　2．理解PCR基因扩增在分子生物实验技术中的重要性。　　3．了解引物设计的一般要求。　　二、实验原理　　多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)：原理类似于DNA的变性和复制过程，即在高温下，待扩增的靶DNA双链受热变

2、性成为两条单链DNA模板；而后在低温情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因

3、扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　PCR反应系统的组成：引物、寡核苷酸、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。　　三、试剂与器材　　1、试剂10×EXTaqBuffer(Mg2+plus)；dNTPMixture(各mM)TaKaRaEXTaq聚合酶5U/μl；模

4、板DNA(已预先稀释)；上、下游引物混合物　　2、器材微量移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，PCR扩增仪(PTC－100)，台式高速冷冻离心机。　　四、操作方法　　1．编辑设定PCR扩增程序。　　2．PCR管中加入灭菌水、缓冲液、四种dNTP、引物、模板、聚合酶。　　3．运行程序进行扩增。　　4．电泳检测扩增结果。　　五、关键步骤与注意事项　　1．试剂湿热灭菌，小管分装，防止污染。2．所用的PCR扩增管、微量移液器的吸头都要灭菌。3．试剂混合时要在超净工作台中，戴上一次性手套，防止污染；要离心混匀。　　4．每次反应都要

5、设置阴性和阳性对照。5．根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现非特异性扩增产物。　　六、思考题目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　1、PCR进行的的基本条件是什么？2、PCR每一循环有哪几个步骤组成？　　3、影响PCR扩增的因素有哪些？4、优化那些条件可以最大限度的减少非特异性扩增？　　PCR扩增产物检测分析琼脂糖

6、凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳　　PCR扩增反应完成之后，必须通过严格的鉴定，才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法，能判断产物的大小，有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者，后者主要用来检测小片段DNA。　　1．琼脂糖凝胶电泳　　这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭染色，在紫外光照射下DNA分

7、子发出荧光而判定其分子的大小。　　用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　制胶：琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配

8、制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解，置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度μg/ml的EB液，充分混匀后倒板。　　加样和电泳：上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工