原核生物的同源重组

《原核生物的同源重组》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、原核生物的同源重组在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（HomologousRecombination）。同源重组的频率与DNA或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。3.1.1原核细菌的基因转移程序原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方

2、法主要有以下几种：1．Ca2+诱导转化法1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收l噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的

3、液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。2．原生质体转化法在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗

4、缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子的吸收。此时，再加入含有待转化的DNA样品和聚乙二醇的等渗溶液，均匀混合。通过离心除去聚乙二醇，将菌体涂布在特殊的固体培养基上，再生细胞壁，最终得到转化细胞。这种方法不仅适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性细菌，也对酵母菌、霉菌甚至植物等真核细胞有效。只是不同种属的生物细胞，其原生质体的制备与再生的方法不同。3．电穿孔转化法电穿孔（Electroporation）是一种电场介导的细胞膜可渗透化处理技术。受体细胞在电场脉冲的作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得DNA分子

5、直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。这项技术最早用于将重组DNA导入真核细胞，但最近已被发展用来转化大肠杆菌等其它原核生物。理论上来说，较高的电压和较长的脉冲时间有利于转化效率的提高，但在这种情况下细胞的生存率也大幅度降低，使得表观转化效率受到很大影响。因此，针对受体细胞的性质合理优化电场强度、脉冲时间和DNA浓度是获得最佳转化效率的必要条件。对于大肠杆菌来说，大约50ml的细菌与DNA样品混合后，置于装有电极的槽内，然后选用大约25微法拉第、2.5千伏和200欧姆的电场强度处理4.6毫秒，每微克DNA可获得109~1010个转化子的理想转化率。虽然电穿

6、孔法转化较大的重组质粒（>100kb）的转化效率比小质粒（约3kb）低1000倍，但比Ca2+诱导和原生质体转化方法效果要好，因为这两种方法几乎不能转化大于100kb的质粒DNA。几乎所有的细菌均可找到一套与之匹配的电穿孔操作条件，因此电穿孔转化方法有可能成为细菌转化的标准程序。4．碱金属离子法用高浓度的碱金属离子溶液（尤其是钾离子）处理细菌，可以提高质粒的转化率。这种方法的优点是能同时转化单体和线型质粒DNA。将细胞悬浮在氯化钾溶液中，然后在35%PEG的存在下，用质粒DNA进行转化，每微克DNA可获得103个转化子。研究表明，单价阳离子能诱导细菌细胞内自溶酶系统的

7、活化，这是转化得以实现的机制。5．接合转化法接合（Conjugation）是指通过细菌细胞之间的直接接触导致DNA从一个细胞转移至另一个细胞的过程。这个过程是由接合型质粒完成的，它通常具有促进供体细胞与受体细胞有效接触的接合功能以及诱导DNA分子传递的转移功能，两者均由接合型质粒上的有关基因编码。在DNA重组中常用的绝大多数载体质粒缺少接合功能区，因此不能直接通过细胞接合方法转化受体细胞，然而如果在同一个细胞中存在着一个含有接合功能区域的辅助质粒，则有些克隆载体质粒便能有效地接合转化受体细胞。因此，首先将具有接合功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的细胞