荧光素酶报告基因检测原理

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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划荧光素酶报告基因检测原理　　荧光素酶报告基因检测　　?原则　　荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。检测步骤如下：　　1)加裂解缓冲液裂解转染的细胞。　　2)将上述裂解物转移入微孔板或者试管中。　　3)加入含有所有酶反应成分，使化学发光反应开始。　　4)用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。　　?特点　　?敏感度和检测范围：5fg荧光素酶　　?发射光

2、的线性范围：10fg—10ng　　?确切的检测限依检测仪器而定。　　?特异性：本文介绍的荧光素酶报告基因系统的操作步骤，通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶　　基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性。不适用于对细菌荧光素酶进行检测。　　?器材和试剂　　?器材目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　在微孔板或试管中，用自动或手动荧

3、光仪、液闪计数仪或者摄影胶片都可以检测到荧光素酶活性，而且高度敏感。当用微孔板时可以是白色，也可为黑色。　　?试剂　　1)荧光素酶检测试剂：荧光素酶检测试剂包括荧光素、ATP、CoA、以及一些添加剂，这些　　试剂可以启动酶反应。这种荧光酶检测试剂的混合物可稳定保存在在-60℃以下12个月，-15℃~-25℃一个月，2℃~8℃只能保存一周。避免反复冻融。应避光保存，因为荧光素在光照下会发生氧化。　　2)裂解缓冲液：下面将加以介绍。　　?基本操作步骤　　下面的操作步骤适用于培养的真核细胞。提取物必须立刻检测，否则必须在-1

4、5～-25℃储存大约一个月。不要反复冻融以避免酶活性的降低。　　1)将荧光素酶报告基因与?-gal对细胞进行共转染，按实验计划进行处理。　　2)彻底吸去培养皿中的细胞培养液，用冰预冷的磷酸盐缓冲液　　小心冲洗细胞3次，彻底去除剩余的PBS。10×PBS缓冲液：NaCl100g，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，用三蒸水定容至1000ml。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、

5、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　3)加入最小体积的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液盖过细胞，例如60mm的培养皿用360?l裂　　解液，35毫米的培养板用150?l裂解液。用橡皮刮将细胞刮离培养皿。将裂解物转移到微量离心管中。Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液：1%TritonX-100，25mmol/L甘氨酰甘氨酸，15mmol/LMgSO4，4mmol/LEGTA，1mmol/LDTT　　4)在漩涡混合器上轻轻振荡细胞裂解液，以最大速度4℃离心以去除细胞碎片。将上清转移到另　　一

6、个微量离心管中，置于冰上以备分析。　　5)在开始化学发光反应之前，将100?l的细胞提取物转移到荧光仪或者液闪计数仪所用的检测　　器皿中。加入360?l荧光素酶分析缓冲液。荧光素酶分析缓冲液：25m　　mol/L甘氨酰甘氨酸，15mmol/LMgSO4，4mmol/LEGTA，2mmol/LATP，1mmol/LDTT　　6)用25mmol/L的甘氨酰甘氨酸稀释荧光素至200?mol/L。荧光素贮液：1mmol/LD-　　荧光素，25mmol/L甘氨酰甘氨酸，10mmol/LDTT。　　7)样品中加入200?l稀释的荧

7、光素液。荧光素在光照下迅速发生氧化，因此丢弃未用完的荧光　　素稀释液。在562nm条件下进行检测。　　?注意事项：目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　1)荧光素酶检测试剂需在15-25℃的条件预平衡后再进行反应，而后依据具体条件进行自动或手　　动检测。当用液闪计数仪时，加入荧光素酶检测试剂后立即轻轻混匀。.加入荧光素

8、酶检测试剂秒内开始检测发射光1-5秒，持续发光20秒后，产生光强度降低，其半衰期为5分钟。2)如果细胞裂解后不能立即对提取物进行检测，样品可以在冰上保存大约5个小时，在-70℃可　　保存数月。　　3)利用上述方法检测冷的样品时，其信号强度将下降5-15%。　　4)在荧光素酶活性较高的情况下，导致信号超出线性范围，可用裂解液将样品进