树脂型质粒DNA小量提取试剂盒

《树脂型质粒DNA小量提取试剂盒》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、树脂型™质粒DNA小量提取试剂盒操作方法1.将3~5ml菌液13,000rpm离心30秒收集沉淀（菌体）。如果用1.5ml或2ml离心管则需反复离心2~3次。2.倒掉上清，将沉淀（菌体）完全悬浮于100µl悬浮液（溶液I）中。上清要尽可能去除干净，可用滤纸吸干。沉淀要用混旋器完全悬浮，否则将直接导致下一步的裂解不彻底，进而影响质粒DNA的产量和纯度。3.加入150µl裂解液（溶液II），轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得粘稠、清亮。不可用混旋器剧烈振荡，否则会使质粒DNA断裂；裂解时间不宜超过5

2、分钟，否则会造成染色体DNA的污染及质粒DNA的产率降低。4.加入150µl中和液（溶液III），轻柔地颠倒混匀10次左右。此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。5.13,000rpm离心8~10分钟，将上清液小心转入一个新的1.5ml离心管中，加入0.4ml纯化树脂（使用前充分混匀），颠倒混匀3分钟。此步是通过离心去除染色体DNA及细菌碎片，并使处于高盐状态下的质粒DNA与纯化树脂结合。6.将纯化树脂及上清液的混和物吸入离心纯化柱中，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。7.将离

3、心纯化柱重新套入废液收集管中，加入600µl80%异丙醇（或80%乙醇），13,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。如果离心纯化柱底部残留有异丙醇（或乙醇），可用滤纸吸干，否则将影响以后的酶促反应。此步是洗涤质粒DNA中混有的杂质及盐类。8.重复第7步1~2次，尽可能将杂质去除。9.取出离心纯化柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管，开盖放置2~3分钟，将残留的异丙醇或乙醇挥发干净。加入50µlTE缓冲液（若用于测序，则加50µl超纯水）于纯化树脂上，不能粘在管壁上。室温下放置3分钟后，13

4、,000rpm离心1分钟。此步是将纯化树脂上的DNA洗脱下来。如果对质粒DNA的需求量较大的话，则重复此步骤1~2次，这样可以获得高产量的质粒DNA。TE缓冲液或无菌超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。1.离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取1~2µl电泳（0.8%琼脂糖，120V，15~20分钟）检测其纯度并目测定量。若发现有RNA污染，可加入0.5µlRNaseA（10mg/ml），37℃保温30分钟。此操作不影响其后续实验。补

5、充说明C如果起始菌液体积较大或收集的菌体较多，溶液I、II、III的用量及其它试剂可相应放大。但操作略有不同，需要时我们乐于提供帮助。C实验证明，少量的RNA污染对于酶切、转化及测序无明显的影响。常见问题及参考意见常见问题可能原因参考意见质粒产量低细胞裂解不充分减少培养物体积。对于高拷贝质粒，培养物体积不要超过5ml，低拷贝质粒培养物体积不要超过10ml按比例增加溶液I与溶液II的体积，使菌体充分悬浮，然后完全裂解细胞非转化细胞的大量生长必须在选择条件下扩增质粒DNA定量不准确通过琼脂糖凝胶电泳与已

6、知浓度的质粒DNA比对不合适的保存条件将质粒DNA溶于无菌超纯水或TE中，于-20℃保存菌液的放置时间过长从培养过夜的新鲜菌液中提质粒DNA菌液培养的时间过长在新鲜的选择平板上挑选一个分隔良好的单菌落，于37℃振荡培养12~16小时质粒的拷贝数太低增加培养物体积，但不要超过10ml溶液II及纯化树脂（于结合液中）有结晶出现将溶液II及纯化树脂（于结合液中）置于37℃温浴30min以上，使结晶完全溶解，且在使用前要充分混匀洗脱温度过低加入无菌超纯水或者TE浸透树脂后，于37℃温育2分钟洗脱液pH<7.

7、0用TE或pH>7.0的无菌超纯水洗脱洗脱液中没有质粒DNA质粒DNA漂出点样孔增加甘油或蔗糖助沉质粒丢失在新鲜的选择平板上挑选生长良好的单克隆进行细菌培养对质粒DNA进行重新转化杂菌污染在选择平板上挑选生长正常的菌落进行摇菌电泳时质粒呈现额外条带开环质粒DNA及线状质粒DNA的存在加入裂解液后，轻轻混匀，时间不要超过5min可能存在缺失突变体有些质粒如cosmids长期保存于E.coli中是不稳定的，在摇菌时应在选择平板上挑选新鲜的，分隔良好的单克隆存在质粒多聚体单酶切后，质粒多聚体酶切为线状质粒

8、DNA，可与染色体DNA的污染相区别存在变性的超螺旋质粒DNA加入裂解液后，碱裂解时间不要超过5分钟RNA污染菌体过量，导致RNaseA相对量不足减少培养菌液的体积溶液I放置时间超过6个月于100µl溶液I中加入1µlRNaseA（10mg/ml），或于洗脱液中加入0.5µlRNaseA，37℃温育30min以上染色体污染操作过于剧烈加入溶液II、溶液III之后，轻柔地颠倒混匀，不要剧烈振荡裂解时间过长裂解时间不要超过5分钟细菌培养期间，出现细胞裂解菌液的培养时间不要