实验五底物浓度

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1、实验五底物浓度、酶浓度对酶促反应速度的影响实验人：刘彦汶学号：20100331024班级：针外2010七同组人：严安、曲畅实验日期：2012-4-25指导老师：路雪雅实验目的1、掌握酶浓度、底物浓度对碱性磷酸酶反应速度的影响的实验原理。2、掌握酶浓度、底物浓度对碱性磷酸酶反应速度的影响的实验方法。二、实验原理碱性磷酸酶可以催化水解底物分了的磷酸基团。本实验用大鼠肾脏碱性磷酸酶催化水解磷酸苯二钠，水解反应如下：OH+Na?P04水解产物苯酚与酚试剂反应呈色，产物可以在660IW波长下比色，以检测苯酚浓度，从而确定反应速度。(-)底物浓度对酶促反应速度的影响当酶量不变时，壊加底物浓度，在初期，反

2、应速度显著增加，当底物浓度增加至一定量吋，反应速度增加缓慢，继续增加底物浓度吋，反应速度不再增力II,这说明所有酶发挥了最大效用，底物的量已过剩。将米氏方程两边取倒数所得到的双倒数方程式称林-贝氏方程：1/V二(Km/V韵•1/[S]+1/V论在林-贝氏方程中，1/V与1/[S]称线性关系。以1/V对1/[S]作图得到一•条直线，其斜率是Km/v“在纵轴上的截距为1/V"在横轴上的截距为-1/臨应用双倒数作图法可以求酶的Km值。(-)酶浓度对酶促反应速度的影响当底物浓度足够高时，在反应过程中底物的减少并不影响反应速度，此时反应速度与酶浓度成正比，本实验可以帮助检查酶促反应条件的准确性和可行性

3、。三、实验器材试管、定量移液管、水浴锅、分光光度计四.实验试剂PH为10的缓冲液、3、6、12mmol/L底物液、(1:4000)酶液、酚试剂、0.5mol/L碳酸钠四.操作步骤及结果(-)底物浓度对酶促反应速度的影响按下表操作试剂(ml)管号123456pIllO.O缓冲液0.50.50.50.50.50.53mmol/L底物液0.16mmol/L底物液0.112mmol/L底物液0.10.30.5蒸傭水0.50.40.40.40.2酶液(1:4000)0.50.50.50.50.50.5底物浓度mmol/L00.20.40.82.44.0混匀后，37°C保温15分钟酚试剂0.50.50

4、.50.50.50.50.5mol/L碳酸钠3.03.03.03.03.03.0混匀后,37°C保温15分钟混匀后，以1号试管为空白对照管，用660nm波长比色，测定各管吸光度底物浓度倒数L/mmol5.002.501.250.420.25A00.3040.3860.4870.5490.6101/A03.292.592.051.821.64以吸光度倒数为纵处标，底物浓度倒数L/mmol为横坐标作图，求米氏常数实验所作图如下(-)酶浓度对酶促反应速度的影响按下表操作试剂(ml)管号12315PH10.0缓冲液0.50.50.50.50.512mmol/L底物液0.50.50.50.50.5蒸

5、憾水0.50.40.30.20.1酶液(1:4000)0.10.20.30.4混匀后,37°C保温10分钟酚试剂0.50.50.50.50.50.5mol/L碳酸钠3.03.03.03.03.0混匀后,37°C保温15分钟混匀后，以1号试管为空口对照管，用660nm波长比色，测定各管吸光度酶浓度(1:4000)X1501234A00.1390.1980.2370.305以吸光度为纵坐标，酶浓度(1:4000)X15为横坐标作图，观察反应速度和晦浓度的关系【附注】1号试管是空白管不加酶液(在酶浓度试验屮，应同时做相同的不同酶浓度的对照管，以校正酶液本身可能存在天然酚含量，但在本实验中，所用酶液

6、中天然酚含量较小，可略去不计)实验所作图如下六、结论及讨论结论1、根据所作图，乂由于吸光度A反映的是酶促反应的速率的快慢，即A与反应速度成正比，由此可推知1/V与1/[S]称线性关系。以1/A对1/[S]作图得到一条直线，其在横轴上的截距为-1/Kmo应用双倒数作图法可以求酶的Km值。由图可求出Km=0.202、当底物浓度足够高时，在反应过程屮底物的减少并不影响反应速度，此时反应速度与酶浓度成正比。讨论1、曲于处标纸不够充裕而使作图不够精确，最终使作图所求Km值产生误差。2、由丁分光光度计本身的误差而使实验所得数据冇一定的误差。