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1、第三章：香菇种质资源的SRAP分析1材料与方法1.1供试菌株为本实验宗保存菌种，香菇品种名录见第二章表2.1。1.2.1试管斜面培养基PDA培养基200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂、lOOOmL水。1.2.2液体PDA培养基PDA培养基200g马铃薯、20g衙萄糖、1000汕水。1.3试剂仪器SNAP引物为上海博亚生物技术有限公司产品，如下图表3.l;MgCl2和脱氧核苛三磷酸(dNTP,2.5mMeach)>TaqDNA聚合酶(5U/»1)为TaKaRa产品。紫外可见分光光度计:PharmaciaBiotechultrospe
2、c'2000电泳仪：D-YY-12型电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂)凝胶成像系统：TAN0N-2008冷冻离心机:Sigma3K30PCR扩增仪:EppendorfAG22331Hamburg冷冻离心机:Sigma3K30掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机表3.1SRAP引物序列Table3.1NucleotidesequeneeofSequence-relatedAmplifiedPolymophism上游引物Upstreamprimer下游引物Downstreamprimers编号碱基序列编号碱基序列
3、MelTGAGTCCMACCGGATAEmlGACTGCGTACGAATTAATMe2TGAGTCCAAACCGGAGCEm2GACTGCGTACGMTTTGCMe3TGAGTCCAAACCGGAATEm3TGAGTCCAAACCGGAGCMe4TGAGTCCMACCGGAGCEm4TGAGTCCMACCGGAGCMe5TGAGTCCMACCGGAGCEm5TGAGTCCMACCGGAGCMe6TGAGTCCAAACCGGTAGEm6GACTGCGTACGMTTGCAMe7TGAGTCCAAACCGGTTGEm7GACTGCGTACG
4、AATTATGMe8TGAGTCCMACCGGTGTEm8GACTGCGTACGMTTAGCMe9TGAGTCCAAACCGGAGCEm8TGAGTCCAAACCGGAGCEm9GACTGCGTACGAATTACGEmlOGACTGCGTACGAATTTAGEmilGACTGCGTACGAATTTCGEml2GACTGCGTACGAATTGTCEml3GACTGCGTACGAATTGGTEml4GACTGCGTACGAATTCAGEml5GACTGCGTACGAATTCTGEml6GACTGCGTACGAATTCGGEml7GACTG
5、CGTACGMTTCCA1.4菌丝培养将40个香菇冰箱保种菌种接于试管斜而培养基，转管活化7-10天，用接种耙耙碎后，接入250ml三角瓶液体培养基中，每个菌株各接3瓶，于25°C摇床上120rpm培养10天，用400目铜网过滤，蒸饰水冲洗，滤纸吸干，保存于一20°C备用。1.5DNA提取方法同第二章1.5.2CTAB法1.6香菇基因组DNA电泳检测取5u1DNA加1U16X漠酚蓝，在0.8%琼脂糖凝胶(含0.5Ug/mlEB)上电泳,4V/cm电压电泳约1.5h,在凝胶成像仪上照相。1.7香菇基因组SRAP-PCR扩增条件优化SRA
6、P分析在香菇上的应用还没有看见过报道，为探索出适于香菇SRAP扩增反应的最优体系，比较DNA模板、dNTP,随机引物浓度以及Taq酶川量对RAPD扩增的影响，寻找最优化条件。对扩增反应25HL体系的各因子设置了如下梯度：模板DNA用量设置10、15、20、25、30、35、40、45、50ng共9个梯度;随机引物设置2.5umol/L,5umol/L,7.5umol/L,10umol/L,12.5umol/L,15umol/L,17.5Umol/L,20Umol/L共8个梯度;dNTP浓度设50umol/L,lOOumol/L,150
7、Hmol/L,200Hmol/L,250nmol/L,300nmol/L共6个梯度；Mg2+浓度设置1.5mmol,2.0mmol,2.5mmol,3.0mmol,3.5mmol,4.0mmol共6个梯度；TaqDNA聚合酶设置0.5U,1.0U,1.5U,2.0U,2.5U,3.0U共6个梯度。扩增反应体系包JS1UL模板,2.5uL10Xbuffer缓液，2.5mLMg2+(25mmol/L),2.5uLdNTP(each2.5mmol/L),1uLPrimer(10Pmol/L),0.25PLTaqDNAPolymerase(5
8、U/pL)最后用ddHao将总体积补至25uLo扩增反应程序:94°C预变性5min；94°C变性lmin,35°C退火lmin,72°C延伸lmin,5个循环，94°C变性lmin,50°C复性lmin,72°C延伸l
