山荆子cbf转录因子克隆、序列研究和植物表达载体构建

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1、山荆子CBF转录因子克隆、序列研究和植物表达载体构建摘要利用RT-PCR技术从山荆子cDNA中克隆CBF基因，ORF全长756bp,编码252个氨基酸；其氨基酸序列含典型的CBF基因蛋白保守的序列AP2/EREBDNA结合域及CBF家族蛋白特征短多肽序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR)；与Genebank上收录的几种植物CBF基因进行氨基酸同源性比对，结果发现山荆子CBF转录因子MbCBF和苹果CBF/DREB1基因的氨基酸序列相似性为98%；与梅树CBF相似性为67%；进一步构建了植物表达载体，为利用CBF基因提高植物抗逆性奠

2、定基础。关键词山荆子；CBF转录因子；克隆；序列分析；表达载体中图分类号Q789文献标识码A文章编号1007-5739(2013)22-0139-03Cloning,SequenceAnalysisandPlantExpressionVectorConstructionofCBFTranscriptionFactorfromMalusbaccataLIUXiao-danXUYa~weiYEFeiYUXiao-ming(CollegeofBio-engineering,UniversityofAgricultureS&TofJilin,JilinJi

3、lin132101)AbstractTheCBFtranscriptionfactorswereclonedbyRT-PCRtechniquefromtheplantsofMaiusbaccata.Thefull-lengthofopenreadingframe(ORF)was756bp,encoding252aminoacids；TheaminoacidssequenceownedthecharacteristicsofCBFprotein,whichcontainedanAP2/EREBDNAbindingdomainandtwospecial

4、shortaminoacidssequences；TheaminoacidssequencesofMbCBFhadhighlyhomologouswithCBFgenesofotherplantsincludedinGenebank,reached98%withMalusdomestica,and67%withPrunusmumerespectively；ThenweconnectedthegeneintotheplantexpressionvectorPBI121,whichlaidthefoundationfortheutilizationof

5、CBFgenestoimproveplantstresstolerance.KeywordsMalusbaccata；CBFtranscriptionfactor；clone；sequenceanalysis；plantexpressionvector低温在很大程度上限制了植物生长、发育及其地理分布，例如许多重要作物和水果(水稻、玉米、番茄、香蕉等),在低温非冰冻条件下(0-12°C)就会受到损害，产量下降,严重的甚至绝收［1］。如何有效提高植物抗寒性成为目前亟待解决的问题。CBF(C~repeatbindingfactor)转录因子的发现为基因工

6、程改良植物抗逆性提供了一种全新的途径。CBF基因是一类对植物多个抗逆基因表达起调控作用的植物特有的转录因子，能识别并结合逆境胁迫应答相关基因启动子区域的CTR/DRE(C-repeatdehydration-responsiveelement)顺式作用元件，启动下游抗逆基因的表达，从而增强植物的抗逆性：2]oCBF基因的表达水平在植物抗寒性差异中起着至关重要的作用。该文以抗寒性较强的山荆子(Malusbaccata)为试验材料，从该植物中分离并克隆CBF同源基因，对其进行序列分析，并进一步构建了植物表达载体。一方面，为在分子水平上深入理解植物的抗寒

7、机制奠定基础，另一方面，为人们通过基因工程手段进行植物抗寒育种研究提供了新的候选基因。1材料与方法1.1试验材料试验用山荆子新鲜材料采自吉林农业科技学院院内；大肠杆菌菌株DH5a和植物表达载体pBI121由吉林农业科技学院生物工程学院生物专业实验室保存与提供；克隆载体pMD-18vector购自大连宝生物公司；限制性内切酶、Taq酶及其他工具酶、DNAMakerDL2000为大连宝生物产品；T4DNA连接酶和TRizolReagent购自Invitrogen公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒、DNA纯化试剂盒、DEPC等为上海生工产品。1.2试验方法1

8、.2.1山荆子CBF转录因子(MbCBF)的克隆。取49低温胁迫处理2h的幼嫩顶芽，采用TRizol法提取山荆子总RNA。