血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定

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1、.血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定一、实验目的1.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法5.学习柱层析技术二、实验原理蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。（一）粗提原理-盐析法1.盐析法：在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度，或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。2.水化膜减弱、消失。蛋

2、白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。3.蛋白质表面的电荷大量被中和。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。4.由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。（二）脱盐原理-凝胶层析1.盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。2.凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分

3、离的技术。...（三）纯化原理-离子交换层析离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。（四）纯度鉴定-醋酸纤维素薄膜电泳血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。三、材料与方法：（一）实验材料1.样品：人混合血清2.试剂：葡聚糖凝胶G

4、-25(SephadexG-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、各不同浓度的pH6.5醋酸铵缓冲溶液、pH8.6巴比妥缓冲溶液、氨基黑10B染色液、20%磺基水杨酸溶液、饱和硫酸铵溶液、1%BaCl2溶液、漂洗液器材：层析柱、电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、黑色反应板等（二）实验方法取血清1.0ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min1.实验步骤盐析沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白）...过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm

5、）过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm）用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,流出液量约1ml用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,流出液量约1ml凝胶柱层析除盐继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液(2ml)洗脱继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液(2ml)洗脱磺基水杨酸检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液15d收集含有蛋白质的峰液15d继续用2ml0.02mol/LNH4AC缓冲液洗涤继续用0.02mol/LNH4AC缓冲液洗涤约2mlBaCl2检测至SO42-阴性Ba

6、Cl2检测至SO42-阴性用2~3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡用2~3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡离子交换柱层析纯化除盐后收集的球蛋白除盐后收集的清蛋白过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm）过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm）...用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液(3ml)洗脱，流出液量约1ml开始检测蛋白质离子交换柱层析纯化用1ml0.06mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,用约5mL0.06mol/LNH4AC缓冲液流洗，除去α

7、球蛋白和β球蛋白磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的洗脱液每管10d，连续收集3管用0.3mol/LNH4AC缓冲液(约3ml)洗脱，流出液量约2ml开始检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白收集含有清蛋白的洗脱液每管10d，连续收集2管取浓度最高的1管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）离子交换柱再生和蛋白纯度鉴定DEAE-纤维素柱先用6mll.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗，再用10ml0.02mol/LNH4AC缓冲液流洗再生平衡2管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法)用镊子取出薄膜，吸去

8、多余的缓冲液，粗面朝上置于载玻片上，在薄膜一段1.5