T∕CVMA 5-2018 非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法

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1、ICS11.220B41团体标准T/CVMA5—2018非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法Real-timePCRassayfordetectionofAfricanswinefevervirusCVMA中国兽医协会2018-10-24发布2018-10-24实施中国兽医协会发布T/CVMA5—2018前言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。本标准主要起草人：倪建强、王传彬、王

2、琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。CVMA中国兽医协会IT/CVMA5—2018非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括

3、所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3试剂3.1DNA提取试剂DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。3.22×PCR缓冲液2×PCR缓冲液的配制见附录A。CVMA3.3引物探针中国兽医协会3.3.1采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-16

4、60-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'3.3.2可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals）第2.8.1章AfricanSwineFever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCA

5、ATCTTATCGA-1651-3'1T/CVMA5—2018下游引物ASF-OIE-rPCRR：5'-1857-ACGGCNGATCTTGTGGTATC-1876-3'荧光探针ASF-OIE-Probe：5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。3.4阴性及阳性对照阴性及阳性对照的制备方法见附录C。3.5其他试剂消毒液、5U/μLTaqDNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/LPBS（pH7.2）

6、。消毒液配制见附录A，0.01mol/LPBS配制见附录A。4仪器和耗材分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2µL，20µL，200µL，1000µL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。5操作步骤5.1样品采集及运输样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。5.

7、2样品处理中国兽医协会CVMA检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/LPBS（pH7.2）制成匀浆，经10000r/min离心取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。5.3样品保存采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。5.4病毒DNA提取5.4.1DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂

8、，则按照试剂说明书操作。5.4.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1