反义寡核苷酸肝靶向制剂的研究

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2、关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家肖关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被套阅彝氆阕。零入授权沈阳芬麓大学习班赘本攀健论文酶全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学饭论文。本学位论文羼予l、保密口，在豳墨年／口五／年解密后适用本授权书。2、不保密口。(请在以上相应方框内打“4”>作者签名：聊娩2胁年月日年月日浇瓣羲祷走擘诲奄擎往砖文辖喀词表缩略词表童篓茎茎查耋壅妻釜塞苎耋：塞!窑童2查堡墼墼叁兰兰圭兰!!：坚兰圭兰耋摘要反义寡核苷酸是匿魏发展迅

3、速的基露淤疗药秘，与传统药物穗魄，壹接作用予产生蛋鑫魏基嚣，闵鼗受昊有逵择毪黎搿效低毒经。莛冀努予爨夫、求溶霞羧及分予表面带有很强的缀电荷，使其在实际应用中存在稳定忮麓、细胞膜通透率低和产生非特异性的毒剐作用等问题。基于队上原因，本课题患骚针对survivinmRNA编码区438位合成反义寡核苷酸，并将碱性氨基酸(寡聚赖氨酸)共价稻骚臻拳溶往复义寡援努黢，摹l爰多聚粥瓷予憝芬正电性质，获嚣套效戆增热滕璇棒的包封率，提高绷胞膜静通透性。忿静，以十，k烷基结合举巍糖为入翳癌细胞的靶向配体并嵌和猩月旨质体膜上，利用JI

4、千脓细胞表面表达的畿唾液酸糖蛋白受体，构成导向性转运系统。构成配体．脂质体．多聚阳离子聚合物-DNA的复合物，健遴茨义寡棱苷酸对靶凝闲的亲饔力以及缌胞膜的通透性，实现基因治疗的匿豹。本论文主要包括以下内容：1反义寡核苷酸、聚赖氨酸修饰反义寡核苷酸和肝靶向西已体的合成。聚甩适合批量生产的溉磷酰胺方法合成反义寡核营酸(5’cgatggCaCggegcactt3’)。该会畿方法麓摹，酝褥产耱缀菇效滚程缝纯瑟绻淀迭瑟98％鞋主，uv、承和MS鉴定，确认为目标纯舍戆。筏理化性质研究中，测定反义寡核替醴油水分配系数为O．13

5、；等电点为2．24～2．36；稳定性实验研究液明，光照条件和离温条件影响反义寡核瞥酸的稳定性，应谶光4"C保存。均分子量为1000，2000和10000的聚簸氨酸修饰反义寡梭萤酸，通过酶连羧箨氧像还源反应，骞棱营酸豹3’寒糕凝簸氨酸豹缓联率为28～32％；反义骞核箭黢聚赖氨酸修饰物的杂交性质研究绪聚夜明，与未修饰的反义寡核苷酸相比，聚赖氨酸修饰的威义寡核苷酸Tm值略肖下降，但幅度不火，+修饰后的反义寡核枯酸仍能形成稳定的杂交。孥k糖酸镳窝疆鹜黢舞藤餐囊l备了配髂舻卡，℃酸巍糖藏(N-SIVA)，魏方法简单弱行，产

6、物易于绝化。并应用IR、1H-NMR、DSC和TO替方法对N-SLBA进彳予结构确证。2以反义寡核苷酸为模型药物，包封举为指标正交设计优化脂质体处方，并3浇辩鸯箨大攀搏击擘秣语吏串文糖要确定最佳处方和工艺。薄膜分散法制备了脂质体(CLO)、肝靶向脂质体(NID)、均分子量为1000的聚赖氨酸修饰反义寡核苷酸肝靶向脂质体(NLO*LLl)、均分子量为2000的聚赖氨酸修饰及义寡核苷酸肝靶向滕质体(NLO-PL心)翻均分予量务10000戆聚羧氨酸掺镑获义寡竣营酸器靶蠢l簿笈薅(NLO-PL璐)等翱剂，考察了CLO、N

7、LD、NLO．PLLl、NLO．PLL2翻NI．D．PL王3盼融汜能质。实验结果表明，聚赖氨酸均分予爨为1000、2000和10000修饰的反义寡梭背酸的艏质体包封率提高到12％、18％和44％；同时显著改变脂质体的‘电能，分别羹一12。6±毡9徽V，-10。6±1．2mV，o．6±l。ImV，42士13mY窝堇4。9±1．7mV：但对粒轻为秃髭著影嚷，CLO、NLO、NLO-PLLl、NLO．PLL2瘸NLo增娃3酶粒径分别为124±2811111，137±32nm，126±41nm，139出34枷和142±2

8、5nln。以上研究结果说明，随着聚赖氨酸长度的增加，有效的提高反义寡核苷酸的脂质体包封率，但掇慧幅度各不相同。遂是因为不同长度的寡聚赖氨酸共价偶联剃农溶经夏义寡孩蝥羧君，多聚疆枣予豹耱歪宅苓磊程囊耱巾秘了反义寡菝蓑羧豹芬受电，导致降低反义寡核苷酸与脂威体膜斥力作用也备不相同，因而产生了包封率的差异性。3DiI为袋光染料标记脂质体，采用流式细胞仪技术对N-SLBA修饰豹脂质