抗性浸矿细菌选育及抗性机理的研究

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1、中南大学博士学位论文抗性浸矿细菌的选育及抗性机理研究姓名：吴学玲申请学位级别：博士专业：微生物学指导教师：邱冠周;刘新星20070401博士学位论文摘要本研究选育对重金属等毒性离子具有抗性的高效浸矿菌株，并对抗性菌株对重金属等毒性离子的耐受能力、耐受机理、抗性相关基因及基因差异表达、阴离子对细菌的影响等进行研究。用9K培养基分别以Fe2+及元素S作为能源，对来自江西德兴铜矿、湖北大冶铜矿、广西大厂等多个矿区的矿坑水样本进行了硫化矿浸矿细菌的富集、筛选、驯化、分离纯化，得到能氧化Fe2+及元素s的纯化菌株。提取纯化细菌基因组D

2、NA，通过PCR聚合酶链反应扩增出其16SrDNA片段，测定其16SrDNA片段的核苷酸序列，用BLAST对其16SrDNA序列进行比较分析以鉴定选育出的浸矿细菌并构建进化树。在9K培养基中分别加入cu2+，Ag+，H92+，Pb2+，M92+等重金属离子，通过重铬酸钾滴定法测定培养基中的Fe2+浓度来确定所分离的菌株在重金属离子抑制情况下对Fe2+的氧化能力变化并筛选出重金属抗性菌株。对抗性菌株的最高耐受能力进行测定并在最高耐受浓度时对Fe2+的氧化能力进行测定和分析。对筛选出的重金属抗性菌株进行紫外诱变以获得具有更高的F

3、e2+氧化能力及更高重金属离子耐受能力的突变菌株。根据GenBank中的抗性基因序列自行设计抗性基因引物，对实验菌株的重金属抗性基因(抗铜基因、抗砷基因及抗银基因)进行PCR扩增、分子克隆及序列测定，用BLAST搜索工具对上述抗性基因进行分析；对上述抗性基因编码的蛋白质进行分析并构建进化树。在不同铜离子浓度时对抗铜基因差异表达进行分析并进行铜蓝浸矿实验。在以Fe2+为能源的9K培养基中加入不同锌盐，研究在同种阳离子存在时阴离子对浸矿菌株的Fe2+氧化能力的影响。16SrDNA的序列分析结果表明，本研究的实验菌株均为嗜酸氧化亚

4、铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans，简称为At．ferrooxidans)。实验菌株对重金属离子的耐受能力测定结果表明，驯化后筛选出对重金属离子有较高抗性的抗性菌株，对Cu2+，Ag+，H孑+，pb2+，M92+的最高耐受能力分别为32000mg／L，240mg／L，0．9mg／L，3500mg／L，22500mgL。而野生菌株对上述离子的最高耐受浓度分别为19000mg／L，60mg／L，0．1mg／L，400mg／L，13500mg／L，说明驯化后抗性菌株对重金属离子的耐受能力明显增强。

5、对具有较高Cu2+抗性和gg+抗性的抗性菌株进行紫外诱变，获得的突变菌株生长性能稳定，比诱博士学位论文摘要变前菌株及野生菌株具有更高的Fe2+氧化能力和更强的耐受重金属离子性能。其对cu2+和Ag+的耐受能力分别是野生菌的2—3倍，是驯化菌的1．1—1．3倍。对其抗铜机理及抗银机理研究的结果表明：彳tferrooxidans有抗铜基因AFE0454copperresistanceprotein；但没有发现抗银基因silC。在不同铜离子浓度时抗铜基因表达有明显差异。铜蓝浸矿实验发现M26“的浸矿能力明显高于DC4和26“，在C

6、uS浓度为9％时M26”浸出率可达66．87％。对抗铜基因编码的蛋白质进行分析发现了结构域CopD和PeoD。结构域CopD编码抗铜蛋白，而PcoD的预测产物是铜离子导出蛋白。PcoD与CopD均与Cuz+抗性有关。通过自行设计的抗砷基因引物对另一个抗性基因抗砷基因arsHJ荭行PCR扩增、克隆及测序。结果显示，实验菌株的抗砷基因arsH的序列与模式菌株At．ferrooxidansATCC23270的序列有14个碱基不同。对口培H基因编码的arsH蛋白进行分析，找到了一段以硫作为信号的NADPH(还原性辅酶II)依赖的FM

7、N(黄素单核苷酸)还原酶的功能域。推N．4t．ferrooxidans菌中arsH的功能可能与arsC基因编码的还原酶的氧化还原作用有关。除了重金属离子XCAt．ferrooxidans菌的影响，阴离子对细菌生长活性及Fe2+氧化能力也有重要影响，其影响的强弱顺序为：S042_耋C1一

8、istanttoheavymetalsandothertoxicions．andtostudythemicroorganisms’resistancecapacities，resistancemechanisms，responsibleresistancegenes，andtheeffec