硫霉素生物合成基因簇异源表达及其改造

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1、南京师范大学硕士学位论文硫霉素生物合成基因簇的异源表达及其改造姓名：谢锋申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：尚广东20080101南京师范大学硕士毕业论文硫霉素生物合成基因簇的异源表达及其改造’中文摘要碳青霉烯类抗生素是一种有着重要应用的B．内酰胺类抗菌剂，特别是对于有多种药物抗药性的细菌感染有着很好得效果。它们有着很广谱的抗菌活性并且对多数临床上遇到的3-内酰胺酶有抗性。尽管已经证实一些革兰氏阴性茵可以产生碳青霉烯类抗生素，但它们主要还是由链霉菌产生。硫霉素(Thienamycin)是第一个被分离到的碳青霉烯类抗生素。它由StreptomycescattleyaNRRL805

2、7产生，硫霉素被报道为最有效的自然产生的抗生素，它有着超广谱得抗细菌活性，并且对B．内酰胺酶有着极强的抗性。然而，硫霉素很不稳定，但通过化学合成的它的衍生物亚胺硫霉素(imipenem)在临床使用上是一种有着重要用途的抗生素，它与脱氢酶抑制剂西司他丁钠(cilastatinsodium)以1：1等量混合，商品名为泰能(Tienam)。目前硫霉素原始产生菌产量低，组分多，异源表达未见报道，所以我们想通过异源表达的手段来提高它的产量，并有可能对其生物合成基因簇进行改造从而创制新的抗生素。重组工程(recombination-mediatedgeneticengineering)是一种快速

3、而有效的构建载体的有力的方法，也是一种能直接的操纵细菌基因组的方法。入噬菌体的reda基因，是5’--3’外切酶，作用于双链DNA分子而产生3’突出的分子；噬菌体的red13基因，为单链结合蛋白，其结合在DNA分子的3’突出端而防止宿主菌大肠杆菌的DNA内切酶对外源DNA的降解，redB基因同时表现重组酶活性，即促进两个单链、同源DNA分子之间的退火；gam基因，其抑制宿主菌RecBCD外切酶的活性；re,cA基因，其可以提高重组酶的活性。这里我们使用重组工程的方法，一步直接克隆含有整个硫霉素生物合成基因簇的DNA片段。首先设计含有硫霉素生物合成基因簇两端同源臂的引物，然后在Red／

4、ET大肠杆菌中通过同源重组，然后就能得到含有整个基因簇的质粒。尔后我们又对质粒做了改造，也是通过重组工程的方法对质粒上基因簇的一个基因(thnF)进行了新基因(Asml0N．methyltransferase甲基转移酶，Formiminotransfel-a．so亚胺基转移酶)替代。关键词：硫霉素；生物合成基因簇；同源重组；异源表达南京师范大学硕士毕业论文硫霉素生物合成基因簇的异源表达及其改造HeterologousExpressionandModificationoftheThienamycinBiosyntheticGeneClusterAbstractCarbapenemsar

5、caclassof13-1actamantibioticswithimportantapplicationasantimicrobialagents，particularlyininfectionsmediatedbymultidrug-resistantbacteria．Theyshowabroadspectrumofactivityandarerelativelyresistanttomostoftheclinicallybacterial13-1actamases．TheyareproducedbyStreptomycesspecies，althoughtheyhavealso

6、beenidentifiedtobeproducedbygram-negativebacteria．Thienamycinhasbeenthefirstcarbapenemisolated．ItisproducedbyStreptomycescattleyaNRRL8057．Thienamycinhasbeenreportedasthemostpotentofthenaturallyproducedantibiotics，showinganextraordinaryofbroadspectrumofactivity,beinghighlyresistanttobacterial13-

7、1aetamases，andplayinganimportantclinicalroleinthetreatmentofnosocomialinfectiousdiseases．However,thienamycinishighlyunstable，andamoststablederivativeproducedbychemicalsynthesis，namedimipenem，istheantibioticofchoiceforclinicaluse．w