人类未成熟卵母细胞体外成熟培养时间的探讨

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1、独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可

2、以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华中科技大学硕士学位论文前言1978年7月25日世界上第1例试管婴儿LouisBrown在英国诞生[1]，从此,这项技术在欧洲及世界范围内展开。试管婴儿发展到今天已包含有药物刺激超排卵技术、体外授精与胚胎移植(IVF-ET)及其衍生技术、显微操作技术(ICI

3、S)、冷冻保存技术、胚胎种植前的遗传学诊断(PGD)等多项技术。现今不孕不育患者增加，需要通过试管婴儿的治疗方法来助孕的患者不在少数，试管婴儿的治疗上首先会进行超排卵，但是超排卵有其副作用：如造成卵巢过渡刺激综合症（OHSS），或在超排卵后取卵时发现有多个成熟及未成熟卵细胞生成。如果我们可以在OHSS发生前取未成熟卵细胞进行体外培养，成熟后再行体外受精－胚胎移植,给患者提供妊娠机会；对于超排卵后，通过采卵得到的未成熟卵可以通过体外培养成熟，增加卵子利用率，受精后得到更多的胚胎供患者选择，亦可以提供更多的妊娠

4、机会。未成熟卵细胞体外成熟培养即IVM技术（In-vitromaturation）似乎可以很好的解决超排卵的副作用问题，可以更好的利用得来不易但却未成熟的卵子，并且通过获取未成熟卵减少OHSS的过程中，可以减少患者使用超排卵药的时间和金钱，为患者减少一定的经济负担，也为患者减少一定的精神压力。但是目前IVM技术尚不成熟，主要是培养未成熟卵细胞的成熟液不成熟，其成熟液成分尚在实验讨论中，未成熟卵细胞的成熟时间也不确切，因为IVM体外培养时间过长或过短均可能使卵细胞错过最佳受精时间，从而影响受精及妊娠，因此合理

5、的培养时间值得进一步探讨。3华中科技大学硕士学位论文1绪言不孕症患者促排卵以获取成熟卵进行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的治疗过程中常常引起卵巢过渡刺激综合症(OHSS)，且超排卵可使妇女在一个周期产生多个成熟和不成熟的卵子，在OHSS发生之前取未成熟卵进行体外成熟可以减少OHSS，或对治疗周期中所获得的未成熟卵进行体外成熟可以提高患者同一周期卵子利用率。获得的未成熟卵母细胞，通过体外成熟，再行体外受精－胚胎移植,给患者提供妊娠机会。但是目前人类未成熟卵的体外成熟，体外受精的结果尚不满意,未成熟卵母细胞

6、体外成熟时间不确定。本文通过对所收集的205枚未成熟卵体进行外成熟培养，记录未成熟卵体外成熟时间，对培养成熟后的卵通过单精子胞浆注射的方法进行受精，观察受精情况，及受精后卵裂，优质胚胎形成情况。运用统计学方法对比统计GV期及MI期未成熟卵的成熟时间及成熟率，统计GV期及MI期未成熟卵主要成熟时间段，并对GV期及MI期未成熟卵不同成熟时间段的受精率，卵裂率及优质胚胎形成率进行比较，推测未成熟卵体外培养成熟的最佳时间，及成熟后能获得最佳受精，卵裂及优质胚胎的体外成熟时间。6华中科技大学硕士学位论文2理论分析由于

7、卵母细胞合理培养条件及生长机理仍不清楚，而且卵母细胞体外成熟的影响因素很多，因此目前还没有一种既价廉又稳定和安全的商品化的IVM培养液可以提供。目前，国内外各研究机构根据自己的研究目的，技术设备，配以不同的培养液，以摸索成熟培养液的成分，各研究机构大多是在基础培养液中添加其他一些必需和非必需成分,以模拟人体正常生理环境，促使卵母细胞成熟，必需成分包括:激素类(FSH、HCG、雌激素、HMG等)和血清类(胎牛血清、患者血清、人替代血清、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胎儿脐带血清等)；非必需成分包括:生长因子(E

8、GF、IGF-I、Insulin等)和其他成分(丙酮酸钠、丙酮酸等)。2.1IVM基础培养液常用的基础培养基有TCM-199，DMEM，HTF，Ham’sF10，m-Ham’sF10和B2。其中TCM-199应用最广泛[2]，本实验根据自身实验条件选用HTF。2.2血清血清作为未成熟卵母细胞体外培养成熟的必须成分是因为血清中含有一些基本的营养物质如氨基酸、脂类物质、维生素、核酸衍生物、无机物等都是细胞生长所必须的