hiv耐药基因检测平台建立——hiv耐药基因克隆，hiv病毒样颗粒制备及分子检测方法建立

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1、摘要艾滋病(Acquiredimmunedeficiencysyndrome，AIDS)是由人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的传染病，自从1981年第一例病例报道以来，全世界已有超过7000万的人口感染了该种病毒，其中超过三分之一死于该种疾病。尽管目前已经有很多抗艾滋病药物应用于临床治疗，但是这些抗病毒药物均有耐药株产生。因此，作为帮助临床医生选择联合用药方案的重要工具，耐药性的检测就显得十分重要。目前HIV耐药检测方法主要有表型检测和基因型检测。本

2、研究的目的在于建立一种敏感性高、特异性好，检测时间短、费用低，并且能够检测出病毒变异混合株百分比的基因型检测方法。该方法的建立可以使临床医生及时了解患者的HⅣ耐药性，从而为HⅣ治疗方案的选择提供●有益参考。由于HIV耐药株不易获得，并且在实验过程中危险性很大，对实验室的安全性要求很高，本课题拟在体外建立HIV耐药突变库，从而为HⅣ耐药检测平台的建立提供检测模板。通过对HIV病毒逆转录酶(RT)基因进行基因克隆和定点突变，最终获得了四个含有RT基因耐药突变热点的cDNA克隆。此外，本课题运用基因克隆的

3、方法将MS2噬菌体1．7kb片断插入pET28a表达载体中，构建了一个新的重组表达载体。该载体可作为耐核糖核酸酶(RNase)的RNA标准品与质控品制备的通用载体平台，以促进有关标准品和质控品的研究。实验中将HIV病毒RT基因插入该重组表达载体中，通过诱导表达构建了含有RT基因的RNA病毒样颗粒。由于该病毒样颗粒组成与HIV病毒相似，且无感染性，因此可以用来代替HIV耐药株完成从病毒RNA提取、逆转录PCR(RT-PCR)到TaqMan实时PCR整个检测过程，从而对所建立的HIV耐药检测体系进行验证

4、。最后本课题选择了RT基因上的两个耐药突变热点Q151M和Y181C进行耐药检测方法的研究。针对这两个耐药位点的序列特异性，分别设计了普通型TaqMan探针和TaqMan-MGB探针，运用TaqMan实时PCR法进行检测。通过对TaqMan实时PCR反应条件的优化，最终建立了一套能够很好地区分耐药突，交的TaqMan实时PCR反应体系。与传统的HIV耐药检测方法相比，本课题所建立的TaqMan实时PCR法具有以下优点：1．灵敏度高、特异性好：2．检测时间短、费用相对较低；3．可以对野生型与耐药突变型

5、的混合样品进行检测；4．可以检测出混合样品中的野生型与突变型各自所占的百分比：5．可以实现高通量检测。该方法的建立为HIV耐药检测方法的研究提供了新的思路．相信通过对反应条件的进一步优化，该方法可以应用于更多其它HIV耐药位点的检测。北京工业大学理学硕士学位论文关键词；HIV耐药；TaqMan实对PCR；TaqMan-MGB探针；定点突变；病毒样颗粒ⅡABSTR^(玎ABSTRACTSincethefirstrclx"toftheacquiredimmunodefieierteysyndrome(A

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