NYT575-2002-牛传染性鼻气管炎诊断技术.pdf

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1、11.220IsC4S1中华人民共和国农业行业标准NY/T575-2002牛传染性鼻气管炎诊断技术Diagnostictechniquesforinfectiousbovinerhinotracheitis2002一08一27发布2002一12一01实施中华人民共和国农业部发布气7勺NY/T575-2002月U舀牛传染性鼻气管炎(infectiousbovinerhinotracheitis.简称IBx)是II)牛地痊病毒I型(BHV-I)感染家养牛和野生牛引起的一种病毒性传染病，被世界动物卫生组织'WorldOrganizationforAnimalHealth(英).O

2、fficeInternationaldesEpizooties(法),OIE〕列为B类疾病.我国农业部列为二类动物疫病该病广泛分布于世界各地，该病死亡率较低，许多感染牛呈亚临床症状经过往往由于细菌继发感染导致更为严重的呼吸道疾病。本标准所规定的技术与OIE推荐的相应技术一致本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由个国动物检疫标准化技术委员会归no本标准起草单位:农业部动物检疫所。本标准主要起草人;封启民、李昌琳、李晓成、李其平。NY/r575--2002牛传染性鼻气管炎诊断技术范围本标准规定了牛传染性鼻气管炎(QBR)诊断技术要求。本标准规

3、定的病毒分离方法适用于牛传染性鼻气管炎病毒的分离;微量血清中和试验和酶联免疫吸附试验适用于牛群检疫、流行病学调查及牛群抗体水平的检测。2牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定2门材料准备2门门病料的采集2.1.1.1呼吸道拭子:用灭菌拭子伸人鼻道采取分泌物，然后放人含青霉素1000IU/ml，链霉素」000dig/mL,1,H7.2的Earles液中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，并用相同的方法处理。2.1.1.2阴道拭子:用棉拭子采集脓疙性外阴阴道炎早期病变的阴道私液，放人含青霉素1000IU/mL,链霉素1000pg/mL,pH7.2的Earles液中2.1.1.3脑组织样品:在剖检

4、时无菌采集脑组织2.1.1.4流产胎儿组织样品刚死亡的胎儿，无菌采集肺、’肾、脾等各种组织样品，放人每1.0mL含有1000IUr,霉素,1000pg链霉素,pH7.2的Earles液中。2.1.1.5精液:至少采集新鲜精液，或冷冻精液。sm工，置液氮中保存备用212样品的运送采集的样品立即放人4(、冰箱保存，在24h内送到实验室2门.3样品处理2.1.31收到棉拭子样品后，先经冻融两次，并充分振动，拧干棉拭子，将样品液经10000r/min离心10min，取上清液作为组织培养的接种分离材料2.1.3.2组织样品先用Earles液或Hank、液(pH7.2)制成20%的匀浆

5、悬浮液，再经10000r/min离心10min，取上清液作为接种分离材料2.1.33精液冻融两次或超声波裂解，再经10000r/min离心10min，新鲜精液通常对细胞有毒性，在接种前应预先作稀释处理，用Earles液作1，15稀释。2.2操作方法样品接种:取经处理过的样品。.2ml接种到已形成良好单层的牛肾或肇丸原代或次代细胞培养瓶中甸份样品接种4瓶，于37C吸附1h后，倾去接种液，用Earl。液洗三次，最后加人含3%(不含MR抗体)的犊牛血清细胞维持液lm工一。置37C培养，逐日观察细胞病变;若7天仍不出现致细胞病变，则收获培养物继代于新制备的细胞上、盲传三代后，观察细

6、胞病变，出现病变者收获培养物，保存于一7。〔、待鉴定。2.3病毒鉴定病毒致细胞病变特点是细胞变圆，聚合，呈葡萄串状、拉网状最后脱落。取出现上述病变的细胞培养物，经冻融、裂解两次后，以10000r/min离心10min，取上清再作下列试验。1vv/T575-20022.3门组织培养感染剂f(TCID5o)的测定按Reed-Muench方法测定，计算分离物TCID.终点2.3.2分离物作血清中和试验川IBR标准阳性血清(效价1:32以上)和阴性血清分别与该分离物作中和试验(固定血清稀释病毒法)按Rccd-Muench法分别汁算TCID如分离物引起典型的1138细胞病变，并且经血

7、清中和试验.其阳性血清组和阴性血清组的TCID对数之差于2.5，则判该分离物为1BR病毒3微it血清中和试验3门材料准备3.1.1器材灭菌的，6孔细胞培养板，5()川.100pL,300pI微量移液器.灭菌的IV料滴头，无毒透明胶带(其宽度‘。培养板致)，火菌的塑料锥形带盖离心管，倒置显微镜3门.2试验材料MRBaitha-Nu/67弱毒株冻f毒，标准阳性血清，标准阴性血清门3门.3细胞培养液细胞培养液的配制方法见附录A(规范性附录)3门.4细胞无菌采取犊牛肾或皋丸按常规胰蛋自酶消化法制备牛肾(BK)或呆丸(13T