SNT2732-2010-牛瘟检疫技术.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!"!#!"#!"!$%$牛瘟检疫技术规范$%&'&()*(+,'-)-.-/0-''*(1+',+2)!$%$3%%3$%发布!$%%3$&3$%实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局!"!#!"#!"!$%$版权所有·禁止翻制、电子发售前!!言!!本标准依据!"!#$%$"&''(给出的规则起草#本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口#本标准起草单位$中华人民共和国云南出入境检验检疫局%中华人民共和国新疆出入境检验检疫局%中

2、华人民共和国吉林出入境检验检疫局%中华人民共和国深圳出入境检验检疫局#本标准主要起草人$周晓黎%严树发%季新成%王振国%杨建明%花群义%叶玲玲%艾军#!!"!#!"#!"!$%$版权所有·禁止翻制、电子发售牛瘟检疫技术规范%!范围本标准规定了牛瘟病毒的分离及鉴定%聚合酶链和酶联免疫吸附试验检测方法#本标准适用于牛及其他反刍动物牛瘟的诊断和流行病学调查#!!规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件&仅注日期的版本适用于本文件#凡是不注日期的引用文件&其最新版本'包括所有的修改

3、单(适用于本文件#!"!#$)'))!出入境动物检疫采样#!疫病简介牛瘟是由牛瘟病毒引起&牛的急性%高度接触传染性%病毒性疾病&以突然发病%高热%粘膜发炎坏死%病程短%死亡率高为主要特征#可引起牛%绵羊%山羊等反刍动物发病&猪可感染和传播本病'参见附录*(#&!现场检验检疫逐头进行临床检查&根据临床表现和特异性病理变化做出初步诊断#'!采样按!"!#$)'))规定&逐头进行采样&并按规定填写)送样单*送实验室#(!诊断方法(%%!总则用分子生物学%血清学等方法可以对牛瘟作出初步诊断&而要确诊应进行病毒分离

4、鉴定&特别是首次发生地区的病例#此外&对流行的牛瘟病毒的致病性%毒力及抗原性进行分析时&病毒分离鉴定也是最可靠的方法'病毒的分离及鉴定需在生物安全三级实验室进行(#(%!!病毒分离及鉴定(%!%%!材料和试剂(%!%%%%!毒株$采用冻干适应细胞培养的牛瘟鸡胚化弱毒株或牛瘟+,-./.+',疫苗株#(%!%%%!!标准血清$牛瘟标准阳性血清%阴性血清#(%!%%%#!细胞$犊牛原代肾细胞或"(0,狨猴类淋巴母细胞或非洲绿猴肾细胞'1.23(#$!"!#!"#!"!$%$版权所有·禁止翻制、电子发售(%!%

5、%%&!细胞培养液%维持液%分散液配制见附录"#(%!%%%'!无牛瘟病毒抗体犊牛血清'0456'789灭能(#(%!%!!仪器和设备(%!%!%%!乳钵或组织捣碎器%镊子%剪刀%冰箱#(%!%!%!!&:%(4孔细胞培养板%微量移液器%滴头%二氧化碳培养箱%倒置显微镜#(%!%#!样品的采集及处理(%!%#%%!样品的采集用肝素或乙二胺四乙酸二钠'终浓度分别为$';!7=(抗凝采集全血&充分混匀后&装冰盒'不冰结(送往实验室&分离出白血球进行牛瘟病毒分离#也可用死亡动物的脾脏%肩前或

6、肠系膜淋巴结等样品'可冻结保存运输(进行病毒分离#(%!%#%!!样品处理(%!%#%!%%!血液$0'''2!789离心抗凝血$0789&在血浆和红血球之间获得棕黄层&无菌取出&加入&'7=无菌生理盐水&洗涤离心&除去血浆中的所有中和抗体#用维持液重悬细胞沉淀物&接种敏感细胞#(%!%#%!%!!组织$将样品剪碎用无血清培养液制成&'?悬液&内含&'';!7=两性霉素"&置乳钵或组织捣碎器研磨&经&'''2!789离心&'789&取上清液置@A'5保存备用#(%!%&!

7、接种敏感细胞(%!%&%%!按常规方法制备犊牛原代肾细胞%"(0,狨猴类淋巴母细胞%非洲绿猴肾细胞'1.23(#(%!%&%!!将制成的样品悬液接种长成单层的上述敏感细胞&每份病料接种两孔&每孔接种$7=&置6A5吸附$B&细胞维持液洗涤&次&加细胞维持液$7=&至6A50?二氧化碳培养箱中培养#观察细胞病变'CDE(形成情况#典型的病变是细朐变圆%萎缩%胞质间桥伸长'星状细胞(或形成合胞体#CDE形成的速度随病毒株的不同有所变化#(%!%&%#!培养$$F&若无CDE出现&则盲传两代&无CDE出现判为阴

8、性&出现CDE则需进一步鉴定#(%!%'!病毒鉴定(%!%'%%!病毒中和试验(%!%'%%%%!病毒收获$收获出现CDE的病毒悬液&重新复壮&待CDE达A0?时&收获冻融&次#6次或经超声波处理&&'''2!789离心&'789&取上清液&分装置@A'5保存备用#@$@0(&每个(%!%'%%%!!中和$将分离的病毒液在(4孔板上用无血清维持液作$'倍系列稀释'$'#$'稀释度:孔&每孔0'"=&在其中两孔中加入等量的牛瘟标