地衣芽孢杆菌pelb，amyx，yvdf基因的功能鉴定与表达

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1、摘要摘要地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是芽孢杆菌中最具应用潜力的菌种之一，具有酶系丰富，产酶量高等诸多优良特性。地衣芽孢杆菌基因组序列已于2004年被公布，为利用基因工程手段开发其应用潜力提供了基础。本文从地衣芽孢杆菌基因组DNA中分别克隆了被标注为pelB、amy)(和yvdF的基因，在大肠杆菌等不同宿主中表达出有活性的重组酶并对重组酶表达情况及酶学性质进行了初步分析。对地衣芽孢杆菌基因组序列分析后发现有两条基因可能编码果胶酶，分别被标注为pP阴和pelB，其中对pelB基因的研究迄今未见报道。本文从地衣芽孢杆菌CI

2、CIMB1699染色体DNA中扩增出可能编码果胶裂解酶的基因即旧，插入启动子PQ下游，分别构建了重组质粒pLa-PQ-pelB和pHY-PQ-pelB。重组大肠杆菌JMl09(pLa．PQ-pelB)表达出有活性的果胶裂解酶，酶活力为0．6U／mL，上述实验证明了卵旧基因编码的蛋白具有果胶裂解酶的功能。重组酶的酶学性质显示其最适反应温度为45℃，最适pH为10．5。金属离子Ca2+对重组酶具有激活作用，其中6mmol／LCa2+浓度激活作用最为明显，而M矿+、zn2+、Cu2+能强烈抑制酶活。利用HPLC．ESI．MS对重组酶酶解产物进行测定发现

3、，酶解产物含有不饱和二聚半乳糖醛酸和不饱和三聚半乳糖醛酸。将重组质粒pHY-PQ-pelB导入地衣芽孢杆菌CICIMB1699，获得重组菌后进行发酵实验，发酵液中果胶裂解酶酶活达到4．2U／mL，与原始菌株相比产酶水平提高了60％。对地衣芽孢杆菌14580基因组序列分析显示基因组中有两个基因amy)(和yvdF，其编码的蛋白均具有典型的普鲁兰酶保守区，而有关其基因功能的研究均未见实验研究报道。以地衣芽孢杆菌CICIMB1699染色体DNA为模板通过PCR方法扩增获得amyX和yvdF编码区，分别构建了表达载体pHY-P43．amyX和pHY-P4

4、3-yvdF。含重组质粒pHY-P43．amy)(的重组枯草芽孢杆菌1A717细胞内酶活有明显提高，但细胞外没有检测到明显酶活，该基因可能编码胞内普鲁兰酶。重组枯草芽孢杆菌1A717(pHY-P43-yvdF)表达出有活性的胞外普鲁兰酶，发酵液中酶活力达到4．6U／mL，对其重组酶水解性质分析显示该酶可能为I型普鲁兰水解酶。重组酶酶学性质分析显示该两种重组酶的最适反应温度都为45℃，最适pH为6．5，其中重组酶AmyX在30．80℃热稳定性较好，而重组酶YvdF在55℃以上时迅速失活。重组酶反应不需要金属离子的参与，但是很多离子如Mgz十、Mn2

5、+、Li+、Na+对酶活性有不同程度的促进作用；zn2+、Cf+、C02+、EDTA、SDS对该酶有不同程度的抑制作用。将重组质粒pHY-P43-yvdF导入地衣芽孢杆菌CICIMB1699，测得重组菌的发酵上清液酶活力约为6．8U／mL，较原始对照菌株丑licheniformisCICIMB1699酶活力水平高出2倍。关键词：地衣芽孢杆菌果胶酶普鲁兰酶酶学性质克隆表达AbstractB．1icheniformlswasthoughtanindustrialorganismwhichhassuchgoodcharactersasanti·heat

6、,nonpatllogenic，abundantenzymesystem．ThegenomesequenceofBlicheniformisWaspublishedin2004，whichprovidedanimportantmaterialtothedevelopmentofitSpotentialapplications．Inthispaper’cloningandexpressionofthegenepelB，amyXandyvdFiIldifferentholstswereinvestigatedandecombinantenzymesw

7、erecharacterized．respectively．AcompletestructuregenepelBwhichprobablyencodedpectinasewasclonedfromB．玩惋观彻铆括CICIMB1699bypolymerasechainreaction．TherecombinantplasmidspLa-PQ-pelBandpHY-PQ-pelBwereconstructedwithpelBunderthecontrolofPQpromoter．ThepectinaseWassuccessfullyexpressed

8、inEscherichiacoliJM109viathemediationofplasmidpLa-PQ-pelB．neoptimalp