胃癌lkf6、cdx2基因遗传不稳定和甲基化及蛋白表达关系

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1、杭州师范大学硕士学位论文胃癌KLF6、CD)【2基因遗传不稳定与甲基化及蛋白表达的关系研究目的摘要研究KLF6基因KLF6M1、KLF6M2、KLF6M4、D10S1716位点和CDX2基因D13S220位点的微卫星不稳定性(microsatelliteinstablility，MSI)和杂合性缺失(10ssofheterozygosity，LOH)、KLF6基因在胃癌组织和SGC-7901细胞系中启动子区域甲基化水平对其蛋白表达的影响，阐明KLF6基因遗传不稳定性、启动子区域甲基化与胃癌肿瘤进展的关系，为揭示抑癌基因作用机制和肿瘤发生发展机制，提供实验依据。研究方

2、法(1)苯酚一氯仿抽提法，提取冰冻的胃癌组织和SGC-7901细胞系基因组DNA。(2)PCR一单链构象多态性(Single—StrandConformationPolymorphism，SSCP)、常规银染检测位点的遗传不稳定性。(3)WesternBlot检测蛋白表达。(4)甲基化特异性PCR检测启动子区域甲基化水平。(5)SPSS16．0软件统计分析相关性。研究结果(1)胃癌KLF6基因微卫星位点LOH的检出率为24．49％(12／49)，与胃癌分化程度、浆膜浸润和临床TNM分期无相关性，但与淋巴转移密切相关(P

3、0．77％(12／39)明显高于无淋巴结转移组的0．00％(0／10)。MSI检出率为16．32％(8／49)，MSI与胃癌的分化程度、浆膜浸润程度、淋巴转移和临床TNM分期均无相关性。在胃癌组织中，KLF6的表达缺失率分别为47．83％(22／46)，在癌旁组织中的表达缺失率仅为4．35％(2／46)。KLF6在91．30％(42／46)的胃癌组织中表达较对应正常组织下降，且下降50％以上。49例胃癌组织甲基化频率为81．63％，癌旁正常对照组织甲基化频率为75．51％，无统计学差异(P>O．05)。SGC一7901细胞株中KLF6启动子处于异常高甲基化状态，经过

4、5’．Aza．CdR处理96h后高甲基化的启动子呈去甲基化状态。经过5'-Aza．CdR处理24h后，KLF6蛋白表达增加，且表达强度呈时间依赖关系。杭州师范大学硕士学位论文胃癌KLF6、CDX2基因遗传不稳定与甲基化及蛋白表达的关系(2)胃癌CDX2基因D13S220位点MSI发生率为8．00％，LOH发生率为18．00％，而LOH的检出率与胃癌分化程度负相关，与淋巴转移正相关，且随着肿瘤TNM分期的增加而降低，但与浆膜浸润、TNM分期无相关性。结论KLF6基因LOH的发生率与与淋巴转移正相关。KLF6基因LOH多发生于有淋巴结转移的胃癌，可作为胃癌组织恶变、预后

5、转归的的判断指标之一。在胃癌组织中存在KLF6的明显缺失，5'-Aza—CdR能较好地逆转胃癌细胞SGC-7901的DNA高甲基化，诱导该基因的表达。在胃癌组织中KLF6基因启动子区域存在高甲基化，提示CpG岛高甲基化在胃癌的早期阶段己存在，可能是胃癌发生的因素之一。所以KLF6可能是胃癌发生的重要相关抑癌基因。CDX2基因D13S220位点LOH的发生率与分化程度负相关，与淋巴转移正相关。D13S220位点LOH多发生于中低分化程度和有淋巴结转移的胃癌，可作为胃癌组织恶变、预后转归的的判断指标之一。D13S220位点的LOH可以调控胃癌的发生、进展，LOH可能是C

6、DX2基因失活的重要机制。关键词：胃癌；KLF6；CDX2；遗传不稳定性；甲基化；Westernblot杭州师范大学硕士学位论文胃癌KLF6、CDX2基因遗传不稳定与甲基化及蛋白表达的关系objectiveABSTRACTToinvestigateMSIandLOHoflocusKLF6M1、KLF6M2、KLF6M4、D10S1716ofKLF6gene，D13S220ofCDX2geneanddetectthemethylationstatusofKFL6geneandtheexpressionofproteiningastriccancertissuesand

7、SGC一7901cells，whichwouldrevealthefunctionmechanismofanti—oncogeneandprovideexperimentalbasisformetastasismechanismofcancer．Methods(1)Phenol-chloroformmethodforextractingDNAfromfrozengastriccarcinomatissuesandSGC-7901cells．(2)Polymerasechainreaction—singlestrandconformationpolymorphis