红豆杉内生真菌发酵培养过程中的碳源优化 毕业论文

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1、不同碳源对红豆杉内生真菌发酵培养条件的优化红豆杉内生真菌发酵培养过程中的碳源优化1绪论1.1引言肿瘤的治疗在很大程度上依赖于抗肿瘤药物，抗肿瘤药物研究方兴未艾。紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉树皮中分离提纯得到的植物抗肿瘤药，已有40余年的研究历史。由于其具有良好的抗癌活性和独特的抗癌机理，因而被认为是抗癌药物的“明星”。自1992年以来，紫杉醇已在许多国家成为治疗卵巢癌和乳腺癌的重要药物[[1]张亚妮，董兆麟.一株产紫杉醇真菌发酵条件的研究，西北大学学报，2003，623(3)：310～311]。由于紫

2、杉醇的药源植物——红豆杉属植物生长缓慢，紫杉醇含量很低(低于为树皮干重的0.015%)，而现有的资源又有限，因而紫杉醇的供应一开始就受到人们的关注。多年来人们一直在寻找能替代直接从植物中提取紫杉醇的方法[[2]王淑月译紫杉醇类似物，药学进展，1995，19（3）：159~163、[3]王建锋，吕华鹰，苏文金.植物内生真菌产紫杉醇的研究，微生物学通报，2000，27（1）：58~60]。紫杉醇的化学全合成虽已完成，但路线复杂，目前无商业价值；紫杉醇的半合成在一定程度上为缓解紫杉醇的供求矛盾；近年来分别从红豆杉属（Taxus）中的短叶

3、红豆杉（T.brevifoliaNutt.）、云南红豆杉（T.yunnanensis）、西藏红豆杉（T.wallichinana）等树皮中分离中得到能产生紫杉醇的内共生真菌，这无疑为解决紫杉醇药源危机提供了一种新的途径。1.2内共生真菌内共生真菌(endophyticfungus)是一大类尚未被充分认识的真菌，它泛指那些生活在健康植株中而不引起任何明显病害症状的所有真菌。在整个真菌发展史上，内共生真菌的研究历史并不长[[4]郭良栋内共生真菌研究进展菌物系统2001，20(1)：148~152]。1924年，Lewis首次报道禾本科

4、植物叶片中存在内共生真菌，但此后的研究工作一直很少，直到近30年，对于植物内共生真菌的研究才趋于活跃。自从A.Stierle证明Taxusbrenifolianutt中的内共生真菌Ｔaxomycesandreanae可以产生紫杉醇，对于植物内共生真菌的研究更加引人瞩目[[5]孙剑秋朱红标周东坡等东北红豆杉内共生真菌分离方法的研究齐齐哈尔大学学报1999，15(3)：13~16]。目前为止，内共生真菌生产紫杉醇产量也极低，这就需要进行多方面的研究。本课题是以不同的碳源种类和配比对红豆杉内共生真菌发酵培养条件优化的研究。1.3本论文研

5、究的内容碳源在微生物中是用于合成菌体的含碳物质及其骨架，并为微生物代谢提供能量。除自养菌能以CO2作为唯一碳源外，大多数微生物是以有机含碳的化合物做为碳源和能源。红豆杉内共真菌发酵培养选用的碳源一般有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖等。糖类的种类和浓度对细胞生长的影响很大，本试验运用正交试验设计对发酵培养基的碳源进行优化。2.材料和方法2.1.材料2.1.1试剂葡萄糖AR中国医药集团上海化学试剂公司麦芽糖BA上海生物化学试剂公司蔗糖AR上海化学试剂有限公司9不同碳源对红豆杉内生真菌发酵培养条件的优化花生饼粉无锡第一制药有限公司提供豆饼粉

6、无锡第一制药有限公司提供NH4NO3AR宜兴市第二化学试剂厂琼脂BA中国医药集团上海化学试剂公司蛋白胨BA中国医药集团上海化学试剂公司酵母浸膏BA中国医药集团上海化学试剂公司MgSO4AR中国竟山区塔美化工厂KH2PO4AR无锡市民丰试剂厂CHCl3AR宜兴市展望化学试剂厂CH3OHHPLC上海陆都化学试剂厂精密试纸pH5.4~7.0上海三爱思试剂有限公司2.1.2培养基沙氏培养基：葡萄糖20g，麦芽糖5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，琼脂15~20g，配成1000ml，pH自然，0.1Mpa（121℃）灭菌20分钟，即得。种子培

7、养基：葡萄糖20g，花生饼粉3g，MgSO43g，KH2PO43g，NH4NO33g，配成1000ml。50ml/300ml瓶，0.1MPa（121℃）灭菌20分钟即得。发酵基础培养基：葡萄糖20g，花生饼粉10g，豆饼粉10g，MgSO43g，KH2PO43g，NH4NO33g，配成1000ml。60ml/300ml瓶，0.1Mpa（121℃）灭菌20分钟，即得。2.1.3仪器MJ-2501AT型霉菌培养箱上海一恒科技有限公司MGC-300H型智能型人工气候箱上海一恒科技有限公司LDZX-40型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械

8、厂超净台无锡市空气净化设备厂TDL-5-A冷冻离心机上海东亭科学仪器厂自动高速组织匀浆机江阴市科研器械厂旋转蒸发仪星海生化设备有限公司2.1.4实验材料菌种：Y1117，本实验室保藏（未鉴定）标准品：Paclitaxel，购自Sigma公司3.实验