活体诱导高效提取水蛭素工艺研究

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1、一中文摘要天然水蛭素是迄今为止所发现的最强的凝血酶天然特异抑制剂。在医疗上应用非常广泛。为充分开发水蛭原材料的利用价值，克服传统工艺杀死水蛭所造成的资源毁灭的弊端及粗放的烘干炮制工艺对水蛭素含量的影响。本项研究对比三种传统提取水蛭素的方法，采用仿生法刺激活体水蛭使其分泌出唾液，瞬间收集水蛭唾液，然后应用超滤对唾液进行高效快速膜分离纯化，再经离子交换和凝胶过滤层析中间纯化，最后应用高效液相进一步纯化得到高纯度的水蛭素，达到多次高效提取水蛭素的目的。其中传统提取水蛭素的方法采用硫酸铵沉淀法、PH值沉淀法、有机沉淀法；活体诱导采用猪血+田螺联合诱导的方式诱导出水蛭唾液，然后再收集水蛭

2、唾液。粗级分离比较了PH值沉淀法、硫酸铵沉淀法、有机沉淀法及超滤膜分离法。DEAE-纤维素离子交换层析用0．05mol／L，pH6．0磷酸盐缓冲液平衡，0-1．0mol／LNaC]梯度洗脱，流速30mL／h，进样量为lOOml。所得到的水蛭素溶液蛋白质回收率为6．05％，活性回收率为78．86％，纯化倍数为17．34，比活为201．59hTU／mg。SephadexG-25凝胶过滤树脂层析，以30mL／h的流速效果最好，其收集液比活为1132ATU／mg，蛋白质回收率为8．020，活性回收率为71％，纯化倍数为8．83ATU／mg。HPLC检测水蛭素纯度为92．10％。该工艺的

3、研究，不但保护了黑龙江省医学的自然资源，极大的促进和带动水蛭人工养殖业的发展，也为周边经济增加了新的经济增长点，同时为我国天然水蛭素的产业化开发提供了技术理论依据，使有限的水蛭自然资源达到可持续利用的目的。因此，该项研究在充分挖掘天然水蛭自身潜在的经济价值外，还推动了水蛭养殖业的发展，必将为我国农业产业结构调整和农业增效，农民增收作贡献。关键词：仿生；超滤；水蛭素；分离纯化二Abstract骶enaturalhirudinisthestrongestzymoplasmnaturalspecialinhibitorwhichdiscovereduntilnow．Appliesin

4、themedicalserviceextremelywidely．InordertofulldevelopmentleechrawmaterialUSevalue．Thevictorytraditionalprocessdisposablekillstheresourcesdeconstru瞧ionmalpracticewhichtheleechereatescandextensivedryingconcoctsthecrafttothehirudinCOntentinfluence．Thisresearchcontraststhreetraditionalextraction

5、hirudinthemethod，USeSthe。biologicalmodellinginductionstimulationlivingspecimenleechcausesittosecretethesaliva．collectionleechsalivaInstantaneous，Thenapplesultrafilterscarriesonthehighlyeffectivefastmembraneseparationpurificationtothesaliva，Passesthroughtheionicexchangeandthegelatinfiltration

6、chromatographicanalysismiddlepurificationagain，Finallyappliesthehighlyeffectiveliquidphasefurthertopurifyobtainsthehirudin，Achievesmanytimesthehighlyeffectiveextractionnaturalhirudingoal．Traditionalextractionhirudinmethodforammoniumsulfateprecipitationmethod、PHvalueprecipitationmethod、organi

7、cprecipitationmethod．BiologicalmodellinginductionusesthePigbloodandViviparusunioninductiontheway．ThethickstageseparationhascomparedthePHvalueprecipitationmethod．theammoniumsulfategraduationprecipitationmethodandtheultrafilterdiaphragmpartingmethod．