降钙素基因相关肽对人支气管上皮细胞表达上皮钙粘素的影响与机制

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1、亟±生僮途塞挝銎皇直鎏材料与方法1．实验对象人支气管上皮16HBE“”细胞株由美国加州大学Grueben教授惠赠。2．试剂和仪器2．1试剂DMEM／F12培养基为Sigma产品，胎牛血清、青／链霉素均为国产。CGRP、H．89(蛋白激酶A抑制剂)、H一7(蛋白激酶c抑制剂)、W一7(钙调蛋白抑制剂)为Sigma公司产品。DEPC为BBI公司产品，逆转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTP为MBI公司产品，Tfizol为InvitrogenLifetechnologies公司产品、E—cd引物为Takara(大连宝生物)公司产品，DNAMarker为鼎国公司产品。鼠抗人E—cd单

2、克隆抗体、通用型二抗(生物素标记羊抗兔／大鼠／小鼠／豚鼠IgG)为北京中杉公司产品，DAB／H202显色试剂盒为武汉博士德公司产品。2．2仪器C02培养箱(IT61，日本)、超净工作台(中国苏净集团)、倒置显微镜(日本Nikon公司)、03发生器(湖南有色金属研究院)、低温离心机(日本Nikon公司)、PCR仪(HYBAID)、电泳仪(江苏兴化分析仪器厂)、免疫组化孵育缸、Image-ProPlus5．0图像分析系统。3实验设计3，1实验分组3．1．1正常状态HBECs分组HBECsCGRP处理组(时效关系)：正常对照组、CGRP处理4h组(C4组)、CGRP处理12h组(C1

3、2组)、CGRP处理20h组(C20组)、CGRP处理28h组(C28组)和CGRP处理36h组(C36组)。CGRP浓度为10’8mol／L。印3ECsCGⅪ，处理组(量效关系)：正常对照组、CGRP处理组(浓度为lo。10、lo。9、108和10。7mol／L)。所选时间点为CGRP处理28h。2HBECsCGRP及抑制剂处理组：正常对照组、CGRP处理组、CGRP+H-89处理组、CGRP+H-7处理组和CGRP+W．7处理组。CGRP浓度为104mol／L，H．89、H-7和、Ⅳ_7的浓度均为10‘5mol／L。31．203应激后HBECs分组03应激处理组(时效关系)

4、：03应激停止后Oh组、03应激停止后8h组、03应激停止后16h组、03应激停止后24h组和03应激停止后32h组。CGRP处理组(时效关系)：03对照组、03+CGRP处理4h组(03+C4组)、03+CGRP处理12h组(Os+C12组)、03+CGRP处理20h组(03+C20组)、03+CGRP处理28h组(03+C28组)和03+CGRP处理36h组(03+C36组)。CGRP浓度为10‘8mol／L。CGRP处理组(量效关系)：03对照组、03+CGRP处理组(浓度为lo。10、10。9、10。8和lO‘7mol／L)。所选时间点为cGRP处理28h。03应激后C

5、GRP及抑制剂处理组：03对照组、03+CGRP处理组、03+CGRP+H．89处理组、Os+CGRP+H-7处理组和03+CGRP+W．7处理组。CGRP浓度为10一mol／L，1-1-89、H．7和w．7的浓度均为104mol／L。以上分组时，给予HBECsCGRP处理2h后接着03应激2h，因此给予CGRP处理与03应激停止的时间相隔4h。在03应激后HBECs分组中，03q-CGRP处理4h组(03+C4组)、03+CGRP处理12h组(03+C12组)、03+CGRP处7犟20h组(03+C20组)、03+CGRP处t：里28h组(03+C28组)和03-'}-CGR

6、P处理36h组(03+C36组)分别对应03应激停止后oh、8h、16h、24h和32h。3．2HBECs的处理用含青／链霉素的DI咖EM／F12培养液在37。C、5％C02及饱和湿度的C02培养箱中培养HBECs。待细胞长至培养板的80％左右，换无血清DMEM／F12培养液。03应激：无血清培养24h后，将细胞置于1．5ppm的03箱中应激2h，放回CO：培养箱继续培养，按照实验设计的时间点进行指标检测。亟±堂焦监塞挝抖皇左鎏4．实验方法4．1HBECsE-ed表达的免疫细胞化学染色将培养的HBECs用o．25％的胰酶消化，制成5×106～10‘7／mI悬液。取209l滴于玻

7、片中央。在倒置显微镜下见细胞呈单层排列，然后快速风干。95％乙醇固定15min，滴加0．1％的Triton破膜5min，正常羊血清封闭20min。加入鼠抗人E．cd单克隆抗体后4。C孵育过夜。次日，滴加通用型生物素标记羊生物素标记IgG，37℃孵育30min；辣根酶标记链卵蛋白(S-A／HRP)，37℃孵育30min。DAB／H202显色。蒸馏水冲洗，封片。阴性对照为：PBS缓冲液代替一抗。将细胞盖片，在光镜下观察：E—cd阳性产物显示为明亮的棕黄色颗粒。取相同倍数(×400)拍摄图像。将拍