转基因堆积在棉花新品种选育中的应用

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1、牛中农n太学2009目硕i学位论文(a)■■■—■卜—二二二二二二二]——————————■卜—————————-———·———●●2A(b)■■■■■■二二二二二二=]—--————·-———●}——-—————————————-●_Linkor(c)●■■■■■【二=二二二二=二]—————彳—————。[Hostproteas由(d)图1．1同时用一个启动子表达多个蛋白，两个或多个蛋白质(蓝色方框、粉红色方框)先后表达，(a)内部核糖体进入位点序列(b)连接多肚2^(c)连接序列(d)Nla蛋白酶。每个结构表达产物用箭头标示。黑色蛋白酶酶切位点用红色箭头标出。Fig．1

2、．1Strategiesforexpressingmultipleproteinsfromasinglepromoter．Twoormoreproteins(bluebox，pinkbox)callbeencodedbehindasinglepromoterandseparatedby：(a)aninternalribosomeentrysite(IREs)，(b)foot-and—mouthdiseasevirus(FMDv)2A，(e)alinkersequencethatisasubstrateforahostcellproteinaseor‘dltheNlaprote

3、ase．Theproductsofthetranslallonofeachconstructareindicatedbeneathbyblackarrows．Proteasecleavagesitesareindicatedbyredarrows．武东亮(2000)将两个不同的杀虫基因钾，』一和印玎基因融合，并在两基因之间加上了昆虫肠激酶fEnterokinase,EK)切害4位点的编码序列，达到了两基因的融合并使两基冈到达昆虫体内后分离成两个基因分别行使功能。Bruno实验室利用LP4作为连接肽将两个来源不同的抗苗蛋白基因DmAMPl和RsAFP2融合，转入拟南芥中得NT抗

4、菌的植株，其中聚蛋白的剪切效率在19％一60％之间(FrancoisiE，etal，2002)。Halpin等(1999)利用2A将两个报告基因氯霉素乙酰转移N．NN(cAzONp，葡糖苷酸酶基因(GUS)连接，构建植物表达载体pcAT-2A．GUS转化烟草，Westernblot结果表明聚蛋I刍CAT-2A-GUS可以剪切成两个蛋I!ICAT2A和GUS，在转基因植物体内表达高水平的cAT和GUS；Ralley等(2004)将类胡萝h素合成过程中的两个酶4，转基因堆积在棉花新品种选育中的应用4'-13．oxygenase(caw)和3，3'-13·hydroxylase(e

5、rtz)构建成融合基[丢]pcrtw-2A—crtz，并将其转入烟草和番茄中，得到了含有更多类胡萝卜素的植株，结果显示利用2A融合基因表达系统表达不同的功能基因，各个功能基因的表达量高并可以正确行使功能，预示着2A在转基因植物研究中有广泛的应用前景。2004年，该实验室将LP4的前9个氨基酸和2A融合起来作为连接多肽，同样连接的是基因DmAMPl和RsAFP2，得到了高抗菌性的拟南芥植株，LP4和2A的剪切效率也比单独用LP4提高了很多(RallyL，eta1．，2004)。1．1．2二次转化将两个不同功能的基因构建在不同的表达载体上，通过两次转化导入同一株植物体中。这样可以

6、充分利用现有相当成熟的载体构建以及基因转化技术，不需考虑载体的容量，而现有的质粒载体就能够满足需要，目的基因的数目也可不受限制，但二次转化需要引入多个选择筛选标记基因。在作物育种中，二次转化的不足之处很明显。随着转化基因的数目增多，工作量将增加，试验周期要延长，得到转多价基因植株的难度就越来越大。而且由于在转化时进行多次独立的转化，各个基因的表达水平差异较大。另外，目的基因在植物染色体内的插入一般是随机的。多次独立的转化事件使得多个目的基因很可能整合在多个遗传位点上，那么转基因植株后代的分离复杂，其稳定性差，获得同时含多个目的基因的转基因纯合系比较困难。因此，二次转化对于一些

7、不适用于杂交方法获得双价基因的植物是一种很好的方法，如树木的多基因转化。1．1．3多载体的共转化共转化是将位于不同载体上的多个基因同时转化到同一植物中，是一步法多基因转化。用来共转化的方法包括电激法、PEG介导法、基因枪转化、农杆菌转化，可以同时转化多个质粒载体，也可以在同一个双元载体中引入两个或多个T-DNA转移区，共转化在标记基因剔除方面应用比较普遍，即将标记基因和功能基因构建到不同质粒中或分别插入不同T—DNA区，在下一代基因分离时筛选只含有功能基因而没有标记基因的转基因植株(KomariT，19