乙型脑炎病毒ns1蛋白单克隆抗体制备与其表位的鉴定(7068)

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业太堂一或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：j≯互手于签字日期：．知『f年f月多日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解洹j匕壅些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逦j匕壅些太堂可以将学位论文的全部或部分内容

2、编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：爻歹支仟导师签名：签字日期：2．，Jf年‘月夕日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：仇以’钆签字日期：≯、7年6月>日电话：邮编：摘要流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis，JE)是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一种以蚊虫为媒介传播的人和动物共患的病毒性疾病．乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)与西尼罗病毒(WestNilev

3、irus，WNV)、圣路易脑炎病毒(Saint．Louisencephalitisvirus，SLEV)和墨累河谷脑炎病毒(MurrayValleyencephalitisvirus，MVEV)同属一个血清群。上述病原可导致严重的公共卫生问题，而且其中的两种或多种病原往往在同一地区流行，加之它们在血清学上存在严重的交叉反应，所以建立起针对上述病原的快速、可靠的鉴别诊断方法十分必要。本研究以本实验室保存的SAl4．14．2株NSl基因进行密码子优化后，由人工合成，将NSl基因分别亚克隆至原核表达载体pET-30和pMAL．e5X构建出重组质粒pET-30．opti．NSl和pc5X．opti

4、．NSl。将pET-30．opti．NSl重组质粒验证连接正确后转化大肠杆菌感受态细胞BL21，经IPTG诱导表达后，将表达产物纯化作为免疫原，免疫6周龄BALB／c小鼠；经过免疫、融合、筛选等过程，共获得16株特异性针对NSl蛋白的单克隆抗体，IFA表明其中8株能识别天然状态下的NSl蛋白；将pc5X．opti．NSl重组质粒验证连接正确后转化大肠杆菌感受态细胞ER2523，经IPTG诱导表达后，SDS．PAGE分析结果显示重组的NSl蛋白在原核表达系统中得到大量表达，并部分以可溶形式存在。Westernblot和间接ELISA检测表明该重组NSl蛋白能与猪JEV阳性血清发生特异性反应。

5、以pc5X．opti-NSl表达的MBP—NSl蛋白为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法筛选分泌NSl蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。设计一套包含整个NSl蛋白的51个短肽片段，每个肽段长度为16aa，每两个相邻的短肽之间有8aa的重叠。为表达这些短肽，首先人工合成了表达它们的基因，在编码链的5’端引入BamHI位点，3’端引入XhoI位点。这51个肽段经IPTG诱导后得到了表达，表达产物与制备的单克隆抗体100816．10F7、100816．885、100910．1E8、100816．7G1、100816．4E3、100910．6D8作用，ELISA结果与单抗100816．10F7、10

6、0816．885、100910．1E8、100816．7Gl、100816-4E3、100910．6D8呈现明显的阳性反应，由此可以判定单抗的抗原表位，分别将该区域逐一氨基酸截短表达后与对应单抗反应，结果表明5AIDITRKll、72RDELNVL78、227ETHTL，W232、251KSKHNRREGY260、269DENGIVLD276、341DETTLVRS348序列为该表位的核心序列。关键词：乙型脑炎病毒；NSl蛋白；单克隆抗体；表位]PreparationofMonoclonalAntibodiesagainstNS1ProteinofJapaneseencephalitisv

7、irusandIdentificationofB—cellEpitopesMastercandidate：LikeLiuAdvisor：Prof．YuhongRenProf．RonghongHuaMajor：BasicVeterinaryMedicineAbstractJapaneseencephalitisvirus(JEV)，beingamemberofthefamilyFlaviviridae，iSusuallyi