蜂毒素sp94融合蛋白原核表达载体的构建、表达与其纯化

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1、摘要蚴蝴㈣IIIIIII㈣IIIJill㈣IIIIIIIY17341828。肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前的治疗手段主要采用放疗、化疗和手术，但放疗和化疗在杀伤恶性细胞时对正常细胞也造成了严重损害。靶向治疗则使分子药物特异性结合到肿瘤细胞的某些作用位点，选择性杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅很少损伤正常组织与细胞，克服了传统治疗存在的弊端，因而肝癌的靶向治疗近年来成为研究热点。蜂毒素是一类存在于蜜蜂毒中的抗菌肽，由26个氨基酸组成，具有抗炎、抗关节炎、抗菌、抗病毒等方面的作用，单独使用时有毒性，为达到减毒增效的目的，本实验选择蜂毒素和可以特异性结合到肿瘤细胞表面的靶

2、向头SP94连接形成融合蛋白，根据大肠杆菌密码子偏好性改造碱基序列，其中加入限制性内切酶KpnI和XhoI，以便构建重组载体pET32a．蜂毒素．SP94，然后原核表达融合基因，制备出纯化的融合蛋白，为肝癌的靶向治疗研究与临床应用提供新的思路。利用经过PCR扩增得到的融合基因蜂毒素．SP94，构建了融合表达载体pET32a一蜂毒素．SP94，经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组蛋白的表达，经金属亲和层析、透析除盐、肠激酶酶切后，进行冷冻干燥，制备出纯化的融合蛋白。对构建的重组载体pET32a-蜂毒素．SP94进行融合型表达，结果表明PET32a．

3、蜂毒素．SP94重组载体在大肠杆菌中高效表达，得到较理想的可溶性蛋白，重组蛋白约占细胞总蛋白的30％，超声破碎后50％的重组蛋白以可溶性形式存在。SDS．PAGE分析显示重组蛋白大小与预期理论值一致，纯化酶切后获得高纯度蜂毒素．SP94蛋白。因此，PET32a-蜂毒素．SP94重组载体可以用于融合蛋白蜂毒素．SP94的规模制备，为肝癌的靶向治疗提供新的候选药物蛋白。关键词：蜂毒素．SP94，融合蛋白，载体构建，表达，纯化ABSTRACTLivercancerisoneofthemostcommonmalignanttumorsinChina．Thecurrentt

4、reatmentsaremainlyradiotherapy,chemotherapyandsurgery,butradiotherapyandchemotherapyCandamagethesurroundingnoncancerouscellsseriously．Targetingtherapymakesdrugmoleculesspecificallybindingtotumorcellswhichjustdamageslittlenormalcells．Ithasovercamethedrawbacksofconventionaltreatment，SOt

5、hetargetingtherapyoflivercancerhasbecameahotspotinrecentresearch．Melittinisaclassofantimicrobialpeptidesinhoneybeevenomandconsistsof26aminoacids．Melittinplaysapartinanti-inflammatorytherapy,acesodyne，inhibitarthritis，antivirus，anti-tumorandothers，butmorepronouncedtoxicitywhenitisuseda

6、lone．Toimproveeffectanddecreasetoxicity,fusionproteinWasformedbyconnectingMelittinandSP94whichcouldspecificallybindtothesurfaceoftumorcells．AccordingtoE．colicodonbias，thesequenceoffusionproteinWaschangedandtherestrictionenzymesitesofKpnIandXh01wereaddedinittoconstructtherecombinantexp

7、ressionvectorpET32a-MeliRin—SP94．Thefusiongenewasexpressedandthepurifiedfusionproteinwasprepared．Thestudyprovidednewideasfortargetedtherapyinlivercancerresearchandclinicalapplications．Intheexperiment，Melittin—SP94fusiongenewasobtainedbyPCRandinsertedintopET32avectors．Therecombinantvec

8、torsw