家蝇cdna文库的构建及防御素基因的分子克隆

《家蝇cdna文库的构建及防御素基因的分子克隆》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、家蝇eDNA文库的构建及防御素基因的分子克隆摘要fI昆虫的生活环境分布广泛，因此具有极强的免疫力。-9高等动物不同，昆虫体内没有淋巴细胞，不能合成免疫球蛋白。"-3昆虫受致病菌的侵染或体壁受到机械损伤时，体内迅速合成一类多肽物质，能杀灭致病菌，称之为抗菌肽。自从1980年Boman等从天蚕中分离、纯化出第一种天然抗菌肽一天蚕素(ceeropin)以来，已经有400多种抗菌肽从其他种类的无脊椎动物和脊椎动物中被分离、纯化出来。抗菌肽具有分子量小、热稳定性好、水溶性好、无免疫原性和抗菌谱广的特点。对昆虫抗菌肽的研究，为抗菌和抗癌药物的研究及其应用开辟了广阔的前景。从昆虫中提取天然的抗菌肽既费时

2、又费力，但可以克隆出抗菌肽基因，再进行重组表达，利用基因工程技术生产、开发抗菌药物。y77本文以经大肠杆菌(E．colO和金黄色葡萄球菌(Staph)·lococcusaureus)诱导24小时的家蝇为材料，用异硫氰酸胍：酚：氯仿一步法，从家蝇腹部提取出完整的总RNA。然后采用亲和层析的方法，分离、纯化出mRNA，逆转录合成eDNA，两端加上EeoRI／NotI接头之后，-9表达载体kgtll连接，经体外包装构建成了家蝇抗菌肽cDNA文库。文库的滴度达到了3．46×105pfu／ml，重组率为99．6％。这为以后家蝇抗菌肽基因的克隆奠定了基础。根据昆虫防御素(defensin)的同源氨基酸

3、序列设计一对简并引物，PCR扩增用于构建文库的eDNA，将目的片段进行克隆、测序，得到了长为119bp的家蝇防御素基因片段，经基因库Blast检索证明为一新基因，-9Aedesalbo的防御素defensinD的基因序列相似性达到76％，为进一步的文库筛选或进行3／、5／RACE而获得全长序列奠定了基础。关键词：家蝇抗菌肽防御素cDNA文库分子克隆山东赶学理学硕士论文CoNSTRUCTIONoFcDNALIBRARYoFHOUSEFLY(MUSCADD心"c)ANDMoLECULARCLoNlNGoFDEFENSINGENEAbstractInsectsliveiflavaribleenv

4、ironment，SOtheyhavestrongimmunity．Differentfromhighanimals．insectslackoflymphocytesandcannotsynthesizeimmunodobulins．1hiectionofliveorkilledbacterialandevenasimpleinjury，caninducetherapidappearranceofseveralfamiliesofantibacterialpeptidesinthehaemolymph．Sincethefirstantibacterialpepfide，cecropin，w

5、aspurifiedfromCecorpiawoth(Hyalophoracecropia)byBomanifl1980．morethan400kindsofantibacterialpeptideshavebeenpurifiedfromotherkindsofifivertibratesandvertibrates．Thereseachhasrealedt11attheyarenovel．mostlycationic，small—sizedpeptideswithabroadspectrumofactivityagainstGram—positiveand／orGram—negativ

6、ebacteria．Itlsdifflcultandtime—consumingtopurlfynatureantibacterialpepridesfrominseets．butitisfeasibletoclonethegenesofantibacterialpeptides．tranferthemintotheexpressionsystems，andgetthemedicinebythemethodofgeneticengineering．Inthethesis．totalRNAwasextractedfromtheabdomenofHouseFlyinducedafter24ho

7、ursbyEcoliandStaphylococcusaureuswithGuanidiniumIsothiiocyanate，PhenolandChloroforlTlsingle．stepmethod．Poly(A)+RNAwasisolatedfromtotalRNAusingthemRNAPurificationKitfromPharmacia．ThenthemRNAwasreverselytranscribed