鹅细小病毒特异pcr及其抗体间接elisa检测技术的建立和应用

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1、摘要鹅细小病毒特异PCR及其抗体间接ELISA检测技术的建立与应用预防兽医专业硕士研究生贺娟指导教师黄伟博士副教授1956年我国方定一在扬州发现小鹅瘟(Gooseplagae，GP)，1961年用鹅胚分离病毒并命名为小鹅瘟病毒(GPVirus，GPV)，后定名为鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)。GPV侵害雏鹅和4．8周龄小鹅及雏番鸭(MuscovyDucklings)，传染性强、传播迅速、死亡率达90％以上，严重危害水禽业发展。德、匈、荷、法、英、意、以、日、南、前苏联、和越南等国家

2、有GPV爆发流行文献报道。2004年，ICTV八次报告将GPV新分类为细小病毒亚科(Parvovirinae)依赖病毒属(Dependovirus)。同属成员中还有番鸭三周病的病原，即番鸭细小病毒(Moseovyduckparvovirus，MDPV)。文献报道，MDPV只引起番鸭发病，且与GPV引起的番鸭病十分相似。MDPV与GFV基因组同源性很高，为81．9％，常规血清学方法和分子生物学技术难以区分它们。近年来，我国鹅及番鸭养殖规模发展迅速，疫病危害愈来愈重，生产实际中非常需要能将GPV与MDPV从

3、病原及其抗体进行鉴别诊断的技术。1、本文报道建立的GPV特异PCR方法。用LimnCK报道的ALl8R2／ALl8F2引物和CHUCY报道的GPVR／GPVF引物，对GPV和MDPV参考毒株进行GPVVP3基因中806bp片段和VPl全基因序列(大小为2206bp)扩增，均获得了阳性结果。纯化的PCR产物核苷酸序列比对发现，ALl8R2，AI，18F2引物PCR扩增产物与GenBank中的GPV强毒B株(u25749)和MDPVGD株(AY510603)基因同源性分别为97％和99％，两个病毒PCR产物

4、之间同源性仅为81．1％。GPVF／GPVR引物PCR扩增产物与GPV强毒B株和MDPVGD株比较，同源性分别为97％和99％，两产物之间的同源性仅为80．3％。结果表明，引物ALl8R2／ALl8F2和引物GPVF／GPVR建立的PCR检测技术在结合PCR产物DNA序列测定时可以从基因水平区别GPV和MDPV。PCR及其产物序列测定结合起来的技术被称为PCRS(PCRandsequencing)．应用中我们体会到，PCRS费时(8天)，费用高，每样试剂费80元以上，实际推广应用难度大。为此，根据Zol

5、tanZ报道，新设计引物HJU／HJL，结果是PCR检测时只有GPV参考株出现阳性条带，而MDPV参考株则为阴性。经测序验证，GPV参考株PCR产物与GPV强毒B株核苷酸同源性为99％。采用新引物HJU／HJLPCR技术，勿需DNA序列测定即可确诊GPV，特异，快速(30小时)，费用低，每样试剂费29元。2、运用我们建立的GPV特异PCR方法，对自然发病小鹅组织中病毒分布进行检测。4两南大学只11日龄病死小鹅胰腺(75％)、十二指肠(75％)和肺(75％)检出阳性；4只48日龄病死鹅心、肝、脾、肺、肾、

6、胰腺和脑组织阳性检出率为100％，十二指肠为66．7％。结论是，临床诊断时胰腺胰腺、肺、肾和十二指肠组织病料阳性检测率高。本文确诊48日龄鹅的小鹅瘟，如此大日龄鹅发病，值得重视和研究。3，来自四川、广东、广西、重庆四省市的鹅病料13份，采用ALl8R2／ALl8F2引物和GPVF／GPVR引物检测，阳性样品数分别为8份和4份。将ALl8R2／ALl8F2引物PCR扩增的8份阳性PCR产物DNA序列与GPV强毒B株比较，同源性为96．20％--98．59％，推导的蛋白质氨基酸同源性为95．6％,-．100

7、％，核苷酸变异率较高的位点有8处，即3212bp、3891bp、3828bp、3824bp、3723bp、3442bp、3410bp和3345bp处；氨基酸变异位点有2个，即VP蛋白463位的甘氨酸(G)变成了丝氨酸(s)，485位的苏氨酸(T)变成了丙氨酸(A)。GPVF／GPVR引物扩增的2份PCR阳性产物DNA序列与GPV强毒B株比较，核苷酸同源性为96．00／0和96．3％，推导的氨基酸同源性为95．3％和95．2％。核苷酸变异主要位于3899bp,-4032bp序列(多达12处变异)和VPl与

8、VP2起始密码子之间的区域，即2560bp,--2844bp内(8处变异)。氨基酸变异位点有6个，分别位于VP蛋白的第207、210、525、528、562和707位。亲水性和抗原性分析表明，来自4个省市的8份GPV样品变异很小或没有变异。4、鸭胚致弱的GPVSRW毒株鸭胚尿囊液经氯仿处理，PEG6000沉淀，SephadexG-200层析纯化制备的GPV抗原，以41．75ttg／ml浓度包被后，加入待检血清，以后依次加入兔抗鹅IgG(1：