参附注射液、松果菊苷和虫草素等抗肿瘤活性与对gjic的影响

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1、参附注射液，松果菊苷和虫草素等抗肿瘤活性及对G儿e竹影响中文摘要研究目的迄今，恶性肿瘤仍然是严重威胁人类健康的疾病，尽管已有很多抗肿瘤药物应用于临床，但由于在很多情况下，效果仍然很不理想，再加上毒副作用大和耐药性的原因，因此人们正在努力寻找新的抗肿瘤药物。中医药累积了不少防治肿瘤的经验。研究与临床均证实，中医药以复方治疗为主，成分较复杂，具体到某种药或复方时，疗效尚难确切肯定，稳定性与重复性往往不高，药理机制及靶点尚不明确，这些均有待深入研究。因此，中药抗肿瘤的研究，无论是国外还是国内，仍然方兴未艾。研究表明，具有直接细胞生长抑制或杀

2、伤作用的中药活性成分有姜黄素、B一榄香烯、苦参碱、大蒜素、紫杉醇、丹参酮、羟基喜树碱等。GJIC与肿瘤发生、发展密切相关，加强GJ能作为治疗肿瘤的一个手段。但有关中药与GJIC的研究尚少，已报道的有车前草的乙醇提取成分、丹参酮IIA等。本研究的创新点在于采用对肿瘤细胞的细胞生长抑制或杀伤作用进行筛选与GJIC的相关活性筛选相结合，初步找出具有直接细胞生长抑制或杀伤作用的中药活性成分，并探求能提高GJIC的活性成分，从而为中药的临床应用和作用新靶点的研究提供新的参考资料。实验方法1五种恶性肿瘤细胞株的生长时间和密度的测定实验采用活细胞增

3、殖AlamarB1ue试剂分别测定人胃癌细胞株SGC一7901、人肝癌细胞株Hep-G2、人急性早幼粒白血病细胞株HL一60、小鼠肝癌细胞株H22和小鼠黑素瘤细胞株B16五种肿瘤细胞株在不同浓度各个时间段的吸光值，根据其还原率确定最佳的细胞生长条件。2中药活性成分抗肿瘤活性研究2．1所选药物黄芪甲苷、人参皂苷Rh2、人参皂苷R93、淫羊藿苷、川续断皂苷、阿魏酸、松果菊苷、葫芦巴碱、虫草素、灵芝多糖、灵芝三萜和参附注射液。2．2细胞增殖抑制或杀伤实验分别收获对数生长期的人胃癌细胞SGC一7901、人肝癌细胞Hep—G2和小鼠黑素瘤细胞B

4、16，按照每孔4000个细胞接种入96孔板。过夜培养24h后加药。收获人白血病细胞HL一60和小鼠肝癌细胞H22，按照每孔4000个细胞接种入96孔板后加药。黄芪甲苷、人参皂苷Rh2、人参皂苷R93、淫羊藿苷、川I续断皂昔、阿魏酸、松果菊苷、广州中医药大学2007届博士学位论文葫芦巴碱和虫草素设6个浓度，终浓度分别为OⅢ、5州、lOlabl、20labl、40Ⅲ和80州；灵芝多糖和灵芝三萜设6个浓度，终浓度分别为Omg／L、5mg／L、lOmg／L、20mg／L、40mg／L和80mg／L；参附注射液设6个浓度，终浓度分别为OmL／L

5、、5mL／L、IOmL／L、20mL／L、40mL／L和80mL／L，每个浓度设5个复孔，补足180p1培养液于37℃、5％C0。及饱和湿度条件下培养。每孔加入20111AlamarBlue，用酶标仪分别测定Oh、24h、48h和72h，570nm和630nm波长的吸收值，按照说明书的公式，计算每个浓度及时间段存活率。存活率=!!!墅兰!竺：!!塑坠!×10034798×A0570-80586×Ao。30其中，A。，。和Ae30分别是药物处理组细胞在570hm和630nm波长的吸收值，A‰和A06。分别是对照组细胞在570hm和630

6、hm波长的吸收值。以细胞存活率为纵坐标，药物浓度为横坐标，绘制各组细胞的生存曲线，并计算药物对细胞的Ic。值。2．3流式细胞仪分析把人白血病细胞HL-60按每孔约2．5×106个细胞接种到六孔板中，分为对照组，松果菊替20Ⅲ、松果菊苷40P2d、虫草素20／j．M、虫草素401AM、参附注射液20mL／L和参附注射液40mL／L共7组，每组3复孔。药物孵育48h后，各组细胞经胰酶消化收集后PBS洗3次，用预冷的70％乙醇固定后，PI染色，用流式细胞仪进行凋亡率和细胞周期分析检测。2．4琼脂糖凝胶电泳分别收集经过参附注射液不同浓度处理过

7、的H22细胞，PBS洗涤后采用申能博彩生物科技有限公司试剂盒步骤提取细胞DNA，取7uLDNA提取液加溴芬兰3

8、lL，上样于i．5％琼脂糖凝胶进行电泳(电压30V，2h)，UV下观察结果，用凝胶成像系统拍照。3中药活性成分对GJIC和Cx43表达的影响对参附注射液和松果菊苷、虫草素等十一种补益中药活性成分中，分为正常对照组、芹黄素阳性对照组、18一d甘草酸阴性对照组、黄芪甲苷组、人参皂苷Rh2组、人参皂苷R93组、淫羊藿苷组、川续断皂苷组、阿魏酸组、松果菊苷组、葫芦巴碱组、虫草素组、灵芝多糖组、灵芝三萜组和参附注射液组共15组。药物孵

9、育36h后进行荧光染料划痕实验，初步筛选出对GJIC有作用的药物，并对比这些中药活性成分对Cx43表达的影响。观察LY自伤沿列细胞向邻近细胞传递的距离进行半定量检测。FITC间接免疫荧光法通过FITC标记的Cx43抗体特