大米蛋白提取和分离纯化技术的研究

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1、摘要我国是世界上稻米资源最丰富的国家，年产量达2亿t左右，稻谷加工中占总量。10％～30％的副产品碎米主要用于生产淀粉糖、味精及酿酒等，生产淀粉糖的副产品米渣的利用一直是困扰企业的一个难题，过去一直未能充分合理利用，大多将其充作动物饲料，造成了宝贵蛋白资源的巨大浪费。米渣中蛋白质含量高达40％以上，是提取大米蛋白的极好原料，将大米中的蛋白质合理回收利用，不仅可为人类带来丰富的蛋白资源，消除大米蛋白给传统淀粉及淀粉糖浆生产带来的不利影响；而且还可提高稻米加工水平及副产品附加值，具有重要的社会效益和较高的经济效益。大米蛋白是公认的优质

2、食用蛋白，其生物效价高，属于低抗原性蛋白，不会产生过敏反应，在所有谷物中大米是唯一可免于过敏试验的谷物品种，因而大米蛋白被认为是一种具有高开发价值的植物蛋白资源，受到了全世界研究者们的关注。深入了解其分子组成、结构及其性质是合理开发和利用大米蛋白的第一步，大米蛋白的结构分析和功能评价需要获取高纯度大米蛋白；同时，大米蛋白的高疏水性也使之不能广泛应用于食品领域，因而需要通过改性来提高其功能特性，但目前还未见对已知结构的大米蛋白进行改性研究的报道。因此，对大米蛋白进行分离纯化已成为深入研究大米蛋白构效关系和改性机理的非常必要的前提条件

3、。论文以籼米为原料，首先对大米蛋白的组成特点进行了详细研究，采用Osborne分级分离蛋白的经典方法对大米中的4种蛋白组分清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白进行了顺序提取，结果表明谷蛋白含量最高(84．09％)，其次是球蛋白(9．38％)、醇溶蛋白(3．49％)和清蛋白(3．04％)。采用SDS．PAGE对四种蛋白组分进行分析，研究结果表明：清蛋白的分子量分布为：59．8kDa，42．4kDa，16．2kDa；球蛋白电泳带中对应相对分子量分别为55．2～53．8kDa，25．9--23．4kDa，20．2～17．9kDa，16．5k

4、Da：醇溶蛋白主要有一组相对分子质量为16．8～14．5kDa左右的谱带。按照分子量分布范围可以将谷蛋白明显划分为6个区域：54．6kDa，38．¨7．1kDa，36．3-34．2kDa，25．9~24．1kDa，22．2~21．4kDa，16．3～14．9kDa，谷蛋白组成相对复杂。根据大米中4种蛋白组分的分布特点，确定将碱提酸沉法制备的大米谷蛋白作为后续研究对象，在本实验室前期研究基础上拟定碱法提取大米蛋白(fleeprotein)的条件为：原料大米经粉碎过120目筛，碱液浓度0．05mol／L，料液比1：10，常温提取2h。

5、此条件下可提取73．89％的大米蛋白，所制备的大米蛋白其蛋白含量为87．90％，在pH5～8范围内溶解度不足5％，pH接近11时，大米蛋白的溶解度迅速提高，pill2．5时其溶解度达85．17％。通过高效液相色谱(HPLC)分析不同溶解体系中大米谷蛋白溶液相对分子质量分布发现，在各种溶剂中大米蛋白均未完全溶解，溶出部分之间产生差异，改变溶液pH(pH<3，。pH>10)或加入SDS等提高蛋白溶解度的方法均有利于高相对分子质量蛋白质的溶出。为了将本实验室的前期研究成果有效提升至产业化生产水平，本研究在前期研究基础之上建立了一条中试生

6、产线，采用碱提酸沉法生产出了符合企业标准的大米蛋白，完成了大米蛋白提取工艺的中试放大。目前已经能够稳定生产出蛋白含量在85％以上的大米蛋白粉，达到了中试试验的预期要求。碱提酸沉法初步分离得到的大米谷蛋白系混合物，大米蛋白的结构分析和功能评价都需要获取高纯度大米蛋白，因此需进一步对大米蛋白进行分离纯化。分析本实验室自制大米蛋白的溶解度发现，在pH3～10范围内，大米谷蛋白的溶解度均在10％以下，其低溶解度成为了对其进行分离纯化的困难所在。本研究采用离子交换和凝胶层析探索了碱提酸沉法制备的大米谷蛋白的分离纯化方法。以0．05mol／L

7、NaEHP04-NaOH(pHl2．50)缓冲液溶解碱提大米谷蛋白，利用DEAESepharoseFastFlow离子交换层析介质对碱提大米谷蛋白进行了初步分离纯化，依次用0．10mol／L、0．25moFL、0．40mol／L、0．55moFL的含盐缓冲液阶段洗脱碱提大米谷蛋白，分离得到三个洗脱峰F1、F2、F3，采用HPLC对F3组分进行纯度分析，其纯度为73．63％；在NaEHP04-NaOH缓冲体系中，碱提大米谷蛋白溶解较为完全，利用不同浓度盐溶液将碱提大米谷蛋白按所带电荷强度从小到大进行初步分离纯化是切实可行的。收集F3

8、采用凝胶过滤层析进一步纯化，得到F3．a、F3-b、F3-c、F3-d四个洗脱峰，经HPLC检测，其中F3-d洗脱峰的分子量为38048，纯度达91．14％。关键词：大米蛋白；碱提；溶解度；离子交换层析；凝胶过滤层析；分离纯化IIABSTRACTC