柑橘衰退病毒进化和起源初步分析

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1、中文摘要柑橘衰退病(Tristeza)是由柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV){l起的一种具有经济重要性的病害．广泛分布于世界各柑橘产区，对全世界的柑橘产业造成了严重的威胁。CTV属丁二k线形病毒属(Closterovirus)，病毒粒子簪lIx2，000nm的长线形，基因组约19，300个核苷酸组成的lI=义单链RNA(+ssRNA)，是目前已知植物痫毒基因组中最大的病毒，具有12个开放读码框(ORF)，可以编码19种以上的蛋白质产物。在5’端和3’端各有107nt}11275nt的非翻译医

2、(URT)。CTV存在复杂的株系分化现象，不同的CTV分离株能引起包括茎陷点、酸橙作砧小的甜橙和葡萄柚植株快速死亡在内的多种症状。随着品种结构调整，茎陷点型柑橘衰退病为害日益加重。由于CTV在田问通过蚜虫传播，对其最有效的防治方法是应用弱毒株系交义保护技术(MSCP)，而对其株系研究是应用该技术的基础。本研究从我国野生柑橘资源丰富的地区收集CTV分离株，经直接组织点免疫(DTBIA)和反转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)检测，刚性样品嫁接保存丁二网室锦橙实生苗上。应用RT-PCR扩增CTV分离株的主要农壳蛋白基因(p

3、25基因)，结合限制性内切酶HinfI对PCR产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析，同时对cTV分离株的p25基冈进行单链构象多态性(SSCP)分析，初步明确我国野生柑橘资源感染CTV及其分离株组群构成情况。同时，通过对野生柑橘上的CTV分离株及国内栽培甜橙及柚上的强弱毒CTV代表分离株的部分基因片段(p23、p20，p13、p18、p25、p27、POL、HEL、k17)进行扩增测序，并同国外典型CTV分离株相应基阏片段进行序列比对，绘制基因系统发育进化树状分类l墨I进行遗传进化分析，初步明确野生柑橘上的CT

4、V分离株同国内外栽培品种上CTV分离株间的序列差异程度，为弱毒株保护技术的应用和衰退病毒的进化及起源分析提供相关依据。主要研究结果：1野生柑橘品种的收集j}DCTV检测分别从我国云南、四川、重庆、广西、湖南、江西等野生柑橘主要分布地区收集到79个野生柑橘样品，经中国农业科学院柑橘研究所国家果树种质(重庆)柑橘圃鉴定后进行DTBIA和RT．PcR检测，筛选出共有11个野生柑橘样品携带CTV，带毒率为13．9％，说明野生柑橘存在CTV的感染。阿南大学博十学1青论文2野生CTV分离株的组群构成分析2．1RFLP分析对野生柑橘

5、上的11个cTV分离钵刀j基因经RFLP分析，；tl-72．7％的样品出现单_口肭fIRFLP谱型，其中以第3组群为主，第l组群次之；有27．3％的样品表现出∥5膳№fIRFLP第1、3组群和第2、3组群混合谱型。有一个样品含有p25／HinfIRFLP第4组群，可能是具有潜在保护作用的弱毒株；另外一个样品为第6组群。2．2SSCP分析通过对野生柑橘上的11个CTVp25基因的扩增产物进行SSCP分析，结果表明RFLP分析为混合组群的3个CTV分离株具有4条特征性谱带外，其余分离株均只有两条特征性谱带，说明在野生状态F

6、生存的柑橘植株主要受cTV株系的单一组群为害。并且SSCP分析与RFLP分析的结果相一致。3进化起源分析将野生柑橘上的11个CTV分离株和国内栽培甜橙和柚上的强弱毒代表分离株位于基因组3’端自q刀，、p2D、p13、p18、Jp乃、1,27和位于中部的RdRp枷3j基因的交叠部分POL片段以及5’的HEL，k17基因片段进行扩增和测序。3．1同源性分析将上述9个基因片段的序列进行同源性比对分析，结果表明11个野生CTV基因组的3’端的序列同源性较高，保守性较强，5’端的序列变异较大。在分析的9个基冈片段中位于3’端的叩

7、，基闪的保守性最高，野生柑橘上11个CTV分离株问的核苷酸和氦墓酸序列的同源性分别为92．1％～99．5％希194．8％～100％，同国内栽培品种上的4个代表分离株以及国外栽培妯种上的21个代表株之间的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为91．3％～99．5％和95．2％～100％，91．3％～99．6％和94．3％～100％：11个野生CTV分离株位f基因组5’端的HEL基因片段的核苷酸和氨基酸序列同源性最低为77．0％和86．3％。t，7基因片段的核苷酸和氨基酸序列同源性最低只有65．5％和63．2％。中文摘要3．2遗

8、传进化分析9个基因片段序列的遗传进化分析表明，碱基含鲑GC