双抗体夹心elisa检测大豆11s球蛋白方法的建立

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1、摘要大豆粕是应用较广泛的植物饲料蛋白质资源，其蛋白质含量高达40％～50％，由于大豆蛋白中必需氨基酸含量高，组成合理，容易被动物吸收和利用等优点，大豆已成为现代养殖业中最广泛的饲料原料。但是，大豆中还含有诸如大豆抗原蛋白等多种抗营养因子，这些抗营养因子通过干扰营养物质的消化吸收、破坏正常的新陈代谢和引起动物不良的生理反应等多种方式危害动物尤其是幼龄动物的生长和健康。大豆抗原蛋白作为重要的抗营养因子，建立简单、快速的定性定量检测方法成为了国内饲料学及动物营养学的研究热点。本论文首先开展了大豆1lS球蛋白的纯化、免疫家兔制备大豆1lS球蛋白抗血清，然后以此为基础建立双抗体夹心ELISA方法，快

2、速检测大豆11S球蛋白。试验一：大豆11S球蛋白的分离提取、纯化和鉴定。通过溶剂对比实验及单因素实验确定了从豆粕中提取大豆抗原蛋白的最佳提取溶剂及影响提取效果的相关因素，以Tris-HCL作为提取溶剂，从豆粕中提取大豆抗原蛋白，然后利用响应面分析法对大豆抗原蛋白提取工艺条件进行优化，建立了实验因素为提取温度、提取时间和料液比与大豆抗原蛋白提取效果的动力模型，并对其交互作用进行了分析。采用硫酸铵分级沉淀和SepharoseCL-6B凝胶层析对大豆llS球蛋白进行纯化，采用SDS—PAGE电泳对大豆球蛋白纯度进行鉴定。结果表明：大豆抗原蛋白的理想提取工艺条件为：提取温度19．15℃，提取时间1

3、．085h，料液比(g：m1)l：21．2，在此条件下大豆抗原蛋白和大豆llS球蛋白提取得率分别为34．83％、24．45％，分别较优化自i『Thanh法提取大豆抗原蛋白和大豆1lS球蛋白提高了54．59％、76．15％。经SepharoseCL一6B凝胶层析纯化的大豆1lS球蛋白呈单一洗脱峰，SDS-PAGE电泳显示大豆l1S球蛋白纯度达90．1％。这表明通过该方法可获得电泳纯的大豆1lS球蛋白。试验二：大豆11S球蛋白兔抗血清的制备及其分离纯化。以纯化的大豆1lS球蛋白作为抗原，分别经过背部皮下和腹腔途径对家兔进行免疫，5周后采集大豆“S球蛋白兔抗血清。采用饱和硫酸铵沉淀和Sephad

4、ex6-200凝胶层析对大豆11S球蛋白抗血清进行纯化，采用免疫电泳和SDS-PAFE对其纯度进行鉴定。结果显示5周后可获得效价高达l：32以上的大豆11S球蛋白抗血清，SDS-PAGE电泳结果显示经SephadexG-200凝胶层析纯化的兔IgG出现两条带，分别为其重链和轻链。这表明通过上述免疫方法可获得较高效价的大豆1lS球蛋白抗血清，并且经过Sephadex6-200凝胶层析纯化的大豆llS球蛋白抗血清纯度可达到电泳纯。试验三：大豆1lS球蛋白标准品制备。利用HPLc法从SepharoseCL一6B凝胶过滤后的大豆llS球蛋白中制备纯大豆1lS球蛋白。在SB—C18色谱柱上，以O．1

5、％三氟乙酸水溶液和0．1％--氟乙酸乙腈溶液为流动相，流速为0．8ml／min，采用梯度洗脱方式，制备了大豆1lS球蛋白纯品，经纯度分析表明，所制备的大豆11S球蛋白的纯度高达98％，已基本具备标准品的标准。试验四：酶标抗体制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立。采用过碘酸钠改良法制备酶标抗体，并以此为基础，建立了检测豆粕中大豆llS球蛋白的双抗体夹心ELISA方法。由方阵实验确定包被抗体为1“g／ml、酶标抗体最适稀释度l：800；由正交实验确定最佳封闭时间为0．5h，抗原及酶标抗体最佳反应时间为lh，底物液作用最佳反应时间为20min，灵敏度达2．5ng／ml，线性检测范围在2．5n

6、g／ml～5000ng／ml之间。结果表明该检测方法具有快速、灵敏等特点，可望用于大豆豆粕及其深加工产品中大豆球蛋白含量的检测。关键词：大豆llS球蛋白，提取，纯化，抗血清，ELISAIIAbstractSoybeanmealisaapplicationwiderrangeofplantproteinfeedresources，whichproteincontentashighas40％to50％．Soybeanmealhasbecomethemostwidelyusedfeedingredientsonthemodernaquacultureindustry,becauseoftheso

7、ybeanproteinhasahighlevelsofessentialaminoacids，rationalcompositionandeasytoabsorbanduseofanimals．Butsoybeanmealhasallkindsofanti—nutritionfactors，suchassoybeanantigenprotein．Theseanti—nutritionfactorsleadtodetri