猪α干扰素基因在毕赤酵母中的表达和活性检测

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1、独创性声明本人声明，所呈交的学位(毕业)论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位(毕业)论文作者亲笔签名：雇锈久日期：矽D富．zl箩，⋯r’’论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以

2、采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。不保密，本论文属于不保密。口学位(毕业)论文作者亲笔签名：雇囱欠日期：例子．厶f?指导教师亲笔签名：景日期玖死p，(，／摘要猪的病毒性疾病种类多、危害大，因此研发具有广谱抗病毒作用的猪干扰素制剂具有重大意义。为了更好地利用基因工程技术来开发重组猪干扰素制剂，防治猪病毒性传染病和进一步开展猪干扰素分子生物学研究，本文进行了猪a干扰素基因的克隆、表达及其重组蛋白抗伪狂犬病毒的研究。根据GenBank己登录的猪a干扰素基因序列，设计了含EcoRI和KpnI酶切位点的一对引物，采取聚合酶链式反应

3、(PCR)法，以猪肝DNA为模板进行了PoIFN-a的扩增。PCR产物经纯化回收后，克隆到pMDl8-SimpleT载体上，经序列测定证实克隆到猪a干扰素。将克隆质粒pMD．IFNⅡ和pPICZaC质粒分别用EcoRI和KpnI双酶切，然后连接，转化大肠杆菌，得到重组表达质粒pPiCZaC．IFN伍。经酶切和测序鉴定，PoIFN-a‘成熟蛋白基因片段插入到表达载体pPiCZaC启动子下，并形成正确的开放阅读框(oRF)。用PineI单酶切pPICZaC．玎附a，电击转化感受态的毕赤酵母工程菌X33，最后涂布YPDS+Zeoc矗蹦选择性培养基，置30℃温箱培

4、养3~5天，结果获得多个单菌落。通过提高抗生素浓度，筛选出高抗性的转化子。先用BMGY培养基激活培养，离心后用BMMY培养基重悬菌体。每24小时添加一次甲醇，保持其终浓度为1．O％，诱导表达96小时后，收集菌液。取少量上清液进行SDS-PAGE电泳分析和Western-Blot鉴定。然后用细胞病变抑制法进行rPoIFN-a在BHK-21细胞上抗伪狂犬病毒粤A强毒株的实验。实验结果表明，本研究克隆了猪a干扰素的成熟肽基因序列，全长约50lbp核苷酸，编码166个氨基酸和一个终止密码子组成的成熟多肽；与GenBank中的PoIFN-a基因比较·核苷酸同源性为9

5、7％--,99．2％，氨基酸同源性为93．4％,-97．0％．SDS-PAGE和Western-Blot分析，可见一条分子量约19．4KDa清晰蛋白条带，与理论值相符。抗病毒实验结果显示，rPolFN吨对伪狂犬病毒在BHK-21细胞中早期增殖可呈现抑制作用，抗病毒活性为1．817Xlo慨．结果表明，本实验成功地在毕赤酵母表达系统中分泌表达猪Ct干扰素并进行了rPoIFN-a抗伪狂犬病毒的研究。为基因工程生产rPolTN-a奠定了基础。关键词：猪a干扰素毕赤酵母分泌表达伪狂犬病毒ExpressionofPorcineInterferon一伐GeneinPic

6、hiapastorisandDeterminingofAnti·-PRVActivityAbstractChma'sporcinevirusdiseasesbcx30memoleandmorecomplex．Porcineinterferon-a(PolFN-a)isabroadspeetnmaofcytokinethatplaysimportantrolesonanti-virus，anti-tumorandimmuneregulationagent．InordertodeveloptheapplicationofrecombinantPolFN-apr

7、eparations,topreventporcineviralinfectiousdisease，andtofilrtherexpoundtheresearchofcytokinesinthefieldofmolecularbiology,maturePoIFN-aWasclonedandexpressedinpPlCZaCexpressionsysteminthestudy．ApairofprimerscontainingEx：oRIandKpnIrestrictionsitesweredesigned,accordingtoPoIFN吨geneinG

8、enBank．ThenPolFN-ngenewasclonedfr