酵母双杂交筛选黏细菌转录因子frua相互作用蛋白的研究

《酵母双杂交筛选黏细菌转录因子frua相互作用蛋白的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中英文摘要酵母双杂交筛选黏细菌转录因子FruA相互作用蛋白的研究研究生袁晨燕指导老师毛晓华教授东南大学基础医学院发育与遗传学系发育与疾病相关基因教育部重点实验室中文摘要目的：FruA是黏细菌中决定发育早期细胞定向聚集和后期细胞分化的C信号通路中的一种信号转导蛋白，调节一系列发育基因的表达，遗传学证据提示FruA可以磷酸化，但是迄今为止仍缺少FruA磷酸化的直接生化证据。本研究采用遗传学方法筛查FruA相互作用蛋白，寻找使FruA磷酸化的候选激酶或其它调节因子，以进一步完善与粘细菌发育分化密切相关的C信号

2、转导通路。方法：利用酵母双杂交的方法从黏细菌基因组文库中筛选与FruA相互作用的蛋白。通过限制性内切酶部分消化黏细菌基因组，回收500—3000bp片段随机插入pGADT7载体，将基因组随机片段与酵母转录因子GAL4AD编码基因融合。连接反应液电穿孔导入大肠杆菌，构建黏细菌基因组文库。将YruA完整的编码序列及删除DNA结合结构域后的不完整编码序列分别插入p6BKT7载体，构建两个诱饵质粒pGBKT7一fruA和DGBKT7一，，棚4BI)o以两个诱饵质粒分别对黏细菌基因组文库进行筛选，初次获得的阳性克

3、隆利用三个报告基因经遗传学复筛后，再选择一部分阳性克隆进行GST-pulldown体外相互作用验证。结果：以pC-ADT7载体构建了含有约十万个重组克隆的粘细菌基因组文库；以pGBKT7一fruAAB／7为诱饵质粒，经酵母双杂交初筛、复筛获得9个阳性克隆；以pGBKT7一fruA为诱饵质粒，经酵母双杂交初筛、复筛获得1个阳性克隆。对阳性克隆的插入片段进行DNA序列分析，其中一个克隆编码黏细菌丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶Pknl，另一个克隆编码黏细菌组氨酸蛋白激酶CheA3。其余插入片段的功能不清楚，在数据库中

4、比对检索，其余8个未发现与已知激酶结构域同源的序列。对Pknl和CheA3在内的四个阳性克隆的体外GST—pultdown试验中，Pknl和CheA3，以及克隆D表现有阳性信号。结论：利用酵母双杂交筛选到与FruA具有相互作用的两种不同类型的蛋白激酶Pknl和CheA3，它们可能是FruA的候选激酶。黏细菌发育阶段FruA的磷酸化可能存在复杂的调节机制，涉及一种以上蛋白激酶的参与。关键词：黏细菌C—signalFruA发育酵母双杂交东南大学硕士学位论文Identificationofinteractin

5、gproteinsofFruA，atranscriptionfactorinMyxococcusxaHthbls，byyeasttwo—hybridscreenBYYuanChenyanSupervisedbyProfessorMAOXiao．huaDepartmentofGeneticsanddevelopmentalBiology,SoutheastUniversityMedicalSchoolKeyLaboratoryofDevelopmentalGenesandHumenDisease，Mini

6、stryofEducationAbstractObjective：FruA，atranscriptionfactorinMyxococcusxanthus，isacomponentofC-signaltransductionpathwaywhichisresponsibleforcellaggregationinearlydevelopmentalstageandcelldifferentiationinlaterdevelopmentalstage．Geneticevidencesuggeststha

7、tFruACanbephosphorylated．butthedirectbiochemicalevidenceiSstillabsent．InthisstudyweattempttoconsummatetheC—signalpathwaybyscreeningforcandidatekinasesofFruAandotherproteinregulatorswitllageneticapproach．Method：Yeasttwo—hybridmethodwasappliedt0screenforpr

8、oteinsinteractingwithFnJAfromaMyxococcusxanthUSgenomiclibrary．MyxococcusxanthllSgenomicDNAwaspartiallydigestedwithendonucleaseTaqIandMspI．Fragmentsofapproximately500—3，000bpwererecoveredandclonedintopGADT7；generatingfusion