baff及其受体融合蛋白的构建表达纯化和功能鉴定

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1、中文摘要B细胞激活因子(BcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfamily,BAFF)，又称为B淋巴细胞刺激因子(Blymphocytestimulator,BLyS)是TNF家族成员之一。它可特异性的刺激B淋巴细胞增殖、分化和分泌抗体，对B细胞的存活、发育、分化起到重要的调控作用。BAFF可与三种受体：BCMA、TACI和BAFF．R结合，通过激活NF．KB信号转导途径增强B细胞的抗凋亡能力。BAFF的过表达与系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)及干燥

2、综合征(SS)等许多自身免疫性疾病及B细胞肿瘤的发生和发展有着密切关系。由于受体与BAFF具有高亲和力，可特异性识别BAFF并与之结合，因此体外构建表达的BAFF受体胞外段融合蛋白可中和体内过表达的BAFF，控制B细胞的增殖和活化，缓解和治疗与BAFF相关的自身免疫病和B细胞肿瘤。本课题的研究为开发BAFF拮抗剂治疗BAFF相关疾病提供了实验基础。本课题研究方法：对BAFF及其受体融合蛋白原核重组表达载体进行鉴定，表达受体和配体蛋白并对其进行纯化，在体外研究受体与配体相互作用，并在细胞水平鉴定受体中和配

3、体功能的活性。主要研究结果：(一)BAFF及其受体融合蛋白原核重组表达载体的鉴定：本实验室已将钓取的BAFF及其受体基因片段连接到原核表达载体pET-32a或pGEX6p一1上，对重组质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序鉴定，证明表达载体构建正确。(二)BAFF及其受体融合蛋白的表达与纯化：重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)、JMl09等。在IPTG诱导下，使基因在工程菌中表达，经SDS．PAGE鉴定。融合蛋白分别利用镍金属螯合琼脂糖凝胶亲和层析柱和谷胱甘肽．琼脂糖珠混悬液纯化，经浓缩和浓

4、度测定后分装冻干保存。(三)BAFF受体融合蛋白的活性鉴定：首先通过酶联免疫吸附法检测了BAFF与受体融合蛋白在体外结合情况。然后在体外建立的BAFF刺激小鼠脾细胞增殖模型中，观察到融合蛋白对BAFF的活性有一定得拮抗作用，并呈现时间和剂量依赖性。关键词：BAFF、TACI-gst、BCMA-gst、BAFF．R-trx、融合蛋白、拮抗剂ABSTRACTBcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfamily(BAFF)，alsoknownasBlymphocytesti

5、mulator(BLyS)，isamemberofTumorNecrosisFactor(TNF)family．BAFFcouldbindtoBlymphocytesandstimulatetheirproliferation,differentiationandantibodysecretion．ItissignificanceforpromotingandregulatingthesurvivalanddevelopmentofBlymphocytes．BAFFbindstothroediffere

6、ntreceptors，BAFF一＆TACI,andBCMA,inordertoimprovetheanti-apoptosisactivityofBlymphocytesbyactivatingtheNF—r,Bsignalingpathway．Theover-expressionofBAFFCanpromotesBcelltumorsandautoimmunediseases，suchassystemiclupuserythematosus(SLE)、rheumatoidarthritis(RA)a

7、ndsjogren’Ssyndrome(ss)．Accordingtothehighaffinityofligandandreceptor,thereceptorfusionproteincanrecognizeandbindtotheligandspecificityinordertoneutralizetheredundantligandmolecularinvivoandtocontroltheproliferationandactivationofBlymphocyte．Therefor,the

8、proteinhasthefunctionofrelieveandtreatBcelltumorsandautoimmunediseases．ItwillhelpUStoscreenandevaluateantagonistsofBAFF．ThepurposeofthisresearchistoidentifytheexpressionvectorsofBAFFanditsreceptors，expressandpurifythefusio