杜氏利什曼原虫amastin基因dna疫苗的初步的研究

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1、四川大学博士学位论文声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。申请入：亭企犸指导教师：将四川大学博}学位论文杜氏利什曼原虫amastin基因DNA疫苗的初步研究病原生物学专业研究生李金福指导教师陈建平教授杜氏利什曼原虫(Leish

2、maniadonovani，L．厦)引起的内脏利什曼病(visceralleishmaniasis，VL，又称黑热病)是利什曼病中症状最严重的一种类型，如不经治疗，病死率达90％以上。据wHo，ⅡIR资料，全世界每年新增加50万内脏利什曼病病人，患病人数约250万。目前，对内脏利什曼病采取的主要控制措施仍然是使用葡萄糖酸锑钠(五价锑剂)等药物治疗病人或捕杀病犬以控制传染源，其次是使用驱虫剂或杀虫剂避免被传播媒介白蛉叮咬。然而，抗内脏利什曼病药物普遍存在用药时间长、副作用明显、不能口服以及治疗费用昂贵，绝大多数发展中国家的病人无力承担等问题。近年来，在一些发病地区甚至产生了针对葡萄糖酸锑

3、钠的抗药株，加上艾滋病与内脏利什曼病混合感染情况的出现，使内脏利什曼病的防治形势更加严峻。因此，研制出安全、有效、使用费用低廉的可供临床大规模应用的疫苗，对于控制内脏利什曼病具有十分重要的现实意义。近年来，被称为第三代疫苗的核酸疫苗的出现，为内脏利什曼病疫苗的研究提供了一个新的发展方向。目前，在此方面已有尝试性的研究报道。本研究在查阅国内外大量文献的基础上，首次选用杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)基因作为疫苗候选基因，并首次设计将霍乱毒素B亚单位(CTB)的编码基因ctxB与amastin基因融合，构建了含amastin基因的两种DNA疫苗，免疫接种实验小鼠，对它们的免疫原

4、性和免疫保护性以及CTB的佐剂作用进行了初步评价。本研究共分为五部分：幽川大学博}j学位论文第一部分，以两株杜氏利什曼原虫基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得了与预期大小一致、约552bp的杜氏利什曼原虫amastin基因。将amastin基因定向克隆入原核表达载体pET-32a(+)，构建原核表达重组质粒pET-am勰tin和pET-dog-amastm，进行测序和序列对比分析，并诱导pET-amastin在原核系统中表达出约40kD的融合蛋白。第二部分，利用重叠PCR技术将ctxB基因与amastm基因进行融合，得到etxB／amastin融合基因，并将ctxB／amastin融

5、合基因定向克隆入原核表达载体pET-32a(+)，构建原核表达重组质粒pET-ctxB／amastin，诱导pET-ctxB／amastin在原核系统中表达出约54kD的融合蛋白。第三部分，将amastm基因和ctxB／amastin融合基因定向克隆入真核表达载体peDNA3．1(+)，构建真核表达重组质粒peDNA3．1．amastin和pcDNA3．1-ctxB／amastin，将pcDNA3．1-amastm和pcDNA3．1-ctxBlamastin体外转染N1H3T3细胞后，用免疫荧光法检测到有效的瞬时表达，经G418筛选后存活的转染细胞的总RNA经RT-PCR分别扩增出约5

6、52bp和921bp的目的条带，证实转入基因得到稳定表达；Westernblot检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出20kD和34kD的目的蛋白。第四部分，将构建的真核表达重组质粒用作DNA疫苗免疫BALB／e小鼠，检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、细胞因子IFN-7、IL-2、IL4产生水平以及CTL杀伤活性等指标，评价疫苗的免疫原性。结果发现：pcDNA3．1-amastin和peDNA3．1．ctxB／amastin免疫组的免疫原性均高于空白质粒对照组(P<0．01)；peDNA3．1．ctxB／amastin免疫组的体液免疫和细胞免疫水平均高于pcDNA3．

7、1．amastin免疫组，单因素方差分析显示，差异有显著性(P