日本血吸虫sj23基因转化紫花苜蓿的初步研究

《日本血吸虫sj23基因转化紫花苜蓿的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、华中科技大学硕士学位论文摘要血吸虫病是一种世界性的寄生虫传染性疾病，对人类及家畜的健康安全具有极大的威胁，血吸虫疫苗的研制具有重大的经济价值及社会意义。转基因植物疫苗是近年来发展起来的一种新技术，因其具有廉价、安全、有效等优点，已成为当今疫苗研究领域的热点。紫花苜蓿是全世界应用最广泛的一种豆科牧草，具有较高的营养价值和成熟的遗传操作经验。为了开发血吸虫转基因植物疫苗，本研究将Sj23转化紫花苜蓿，并进行DNA及表达水平的检测，取得的主要成果如下：1.扩增日本血吸虫Sj23基因，经TA克隆和测序验证后，插入p

2、CAMBIA1303的多克隆位点，构建真核表达载体pCAMBIA1303-Sj23。2.以紫花苜蓿为材料，通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404介导，将Sj23对紫花苜蓿进行遗传转化。采用2mg/L2,4-D＋0.5mg/LKT的激素组合在MS培养基上诱导愈伤组织，获得96%的出愈率。再使用50mg/L的Hyg进行延迟筛选后，获得120个抗性愈伤组织。3.提取抗性愈伤组织DNA，使用Sj23引物进行PCR检测获得68个阳性愈伤组织。随机选择10个阳性愈伤组织提取蛋白

3、质进行SDS-PAGE分析，发现在2个愈伤中表达了一条约为23kDa的蛋白质带，经Westernblot检测该蛋白对血吸虫感染的小鼠血清具有免疫原性，表明Sj23可能已经整合到苜蓿愈伤组织基因组中并表达。关键词：日本血吸虫，Sj23，紫花苜蓿，转基因植物疫苗I华中科技大学硕士学位论文AbstractSchistosomiasisisaworldwideparasitecommunicabledisease,whichendangersthehumanandlivestockhealth.Thedevelop

4、mentofschistosomiasisvaccinehasagreateconomicvalueandsocialsignificance.Transgenicplant-derivedvaccinedevelopedinrecentyears,andomparewithothervaccines,it’scheaper,saferandmoreefficacious,andbecomeimportantinvaccinresearch.Medicagosativaisakindofperenniall

5、eguminouscaudexandisthebestandmostimportantleguminousintheworld.InordertodeveloptransgenicplantsSchistosomiasisvaccine,wetransformedtheSj23geneintoaMedicagosativathrouthAgrobacterium-mediated,andidentificatedthetransgeniccallusbyPCRandWesternblot.Themainre

6、sultsareasfollowing:1.AmplifiedtheSj23byPCRandTAclone,thenconstructtherecombinantprokaryoticplasmidpCAMBIA1303-Sj23.2.TransformedthepCAMBIA1303-Sj23intoMedicagosativathroughAgrobacterium-mediated.Inducedthecalluswiththehormoneof2mg/L2,4-Dand0.5mg/LKT.Acces

7、sto96%ofthecallusinductionrate.Bythemethodofdelayscreening,wegot120resistantcalluswiththeoptimumselectionpressureof50mg/Lhygromycin.3.Extractedthehygromycin-resistantcallus’DNAandPCRwiththespecificprimersofSj23,wegot68positivecallus.Chose10positivecalluson

8、randomandextractedtheriprotein,bySDS-PAGEwefound2ofthemexpresseda23kDaproteinwhichnoexistinthenegativecallus.ByWesternblot,wefoundthisproteincouldberecognizedbytheserumfrommiceinfectedwithSchistosomajaponicum