透明质酸发酵法制备及其复合改性研究

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8、il删嗍Y1829655透明质酸(hyaluroIlicacid，简称HA)是一种重要的医药材料和化妆品原料，并被列为新资源食品。近年来，微生物发酵法已经逐步取代了动物组织提取法，成为制备HA的主要方法。在发酵法制备HA的过程中，需要对大量发酵液样品进行HA含量的测定。传统的Bitter．Miur法测定步骤繁琐，以浓硫酸．咔唑溶液为反应试剂，具有一定危险性。本研究考察了十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylall】monium

9、bromide，简称CTAB)与HA反应产生混浊的特性，建立了CTAB比浊法：配制25m咖l的CTAB试液，选择400m作为CTAB比浊法的吸收波长，在室温下，将纯化后的样液与CTAB试液准确反应10min，各样品的测定时间误差控制在10s以内，通过标准曲线测算出待测样中HA含量。试验表明，CTAB比浊法的准确度、精确度和灵敏度均高于Bi地r_Muir法。除了蛋白质外，其它杂质对C即圆比浊法影响较小。该法安全性高，操作简便快捷，适合对大量发酵液样品进行测定，适用于测定HA的分子量范围为≥50ooODa。本

10、研究以马疫链球菌(肌p幻cDcc螂叼甜括砌f，括)为出发菌，通过紫外线和60Co_Y射线辐照相结合的方法对出发菌株进行诱变选育，筛选出无溶血性、HA产量和分子量均较高的突变株NCl68，其HA产量为150．61m∥L，分子量为677000Da。突变株经过多次传代，HA产量和HA分子量保持稳定，溶血性无回复突变现象，为进一步研究发酵法生产HA打下了基础。针对突变株NCl68，通过单因素试验和二次正交旋转回归试验对其发酵培养基进行了优化，并建立了回归模型：Y=174．76168+6．09122X3．9．269

11、43X12．12．92694X22．14．36237X32．12．20569X42由此得到了最佳培养基：酵母膏30g／L，蛋白胨20g／L，葡萄糖5g／L和MgS04·7H201．5g／L，模型预测HA产量为174．76mg／L，验证试验HA产量达到178．53m∥L，模型能较好的预测HA产量。将此培养基应用于5L发酵罐，进行分批发酵试验。研究表明：pH值，初糖浓度，温度和搅拌速度对HA产量均有显著影响。优化的培养条件为：pH值为7．O，初糖浓度为30g／L，温度35℃，搅拌转速200r／min。5L发酵

12、罐分批发酵HA的产量可达3．Og／L。在发酵条件优化基础上，以Logistic，Slogistic和SGompe血三种模型对菌体生长过程中生物量和HA产量进行非线性拟合，结果表明，生物量模型以Logistic模型拟合效果最佳，拟合方程为：y=2．933—2．849达到0．999；而在HA合成拟合中，以Slogistic模型最佳，拟合方程为：y=相关系数R2再7面面：丽可’相关系数R2为0．996；在对基质(葡萄糖)的消耗拟合中，采用DoseResp模型，拟合方程为：y=2．085+为：y=Z．U芍，+26

13、．566相关系数R2为0．991。摘要采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀与超滤相结合的方法对HA进行分离纯化。将发酵液稀释到HA含量为0．6．0．8g／L，加入发酵液体积15％的CTAB溶液(质量分数为10％)，在35℃下沉淀1h，将沉淀置于浓度为1．5mo儿的NaCl溶液中解离4h，选择浓度为70％乙醇进行沉淀。经上述处理后HA得率可达93．8％，HA中蛋白含量可降至1．5％。选择截留分子量为100KDa的超滤膜对经过季铵盐沉淀得到的HA进行超滤，样液浓度为0．02％．O．05％，过膜压力为1lp

14、si，HA得率可达到93．5％，蛋白去除率达到94．0％。经分离纯化后，HA总得率为87．7％，HA中蛋白含量可降至0．09％，葡萄糖醛酸含量可达43．5％，达到医药级水平。为了获得性能良好的HA水凝胶，选择分子量为1500000Da的HA与海藻酸钠(sodi啪alginate，简称SAL)进行复合改性。以醋酸盐缓冲液作为调节pH的试剂，碳化二亚胺(EDC)作为羧基激活剂，已二酰肼(ADH)作为交联剂，制备了HA．SAL复合水凝胶。通过红外光谱验证了HA与SAL之间形成的酰胺键，通过电镜观察了所形成凝胶的

15、微结构。质构特征分析表明，凝胶的硬度随着两种多糖浓度升高而增加，随着H～SAL摩尔比例升高而减小。凝胶的溶胀率与HA的比例成正相关，而与EDC用量成负相关。随着SAL比例和EDC用量的增加，所形成凝胶的抗透明质酸酶降解能力得到提高。所制备的HA．SAL水凝胶具有较高的溶胀率、理化稳定性、天然的生物相容性和一定的生物降解性，具有应用于真皮填充物、组织工程支架材料等生物医药领域的潜在用途。关键词：透明质酸，测定方法，马疫链球菌，诱