苹果果实cdna文库构建

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1、独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在鼯师指导下进孽亍的研究工作及取彳嚣的硬究成聚。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已疑发袭或撰麓过豹鞣究成聚，也零毽含必获褥中国农泣大学或其意教弯撬{鸯豹学位或涯零而使用过的材料。与我一同正作的同志对本研究所做的任何贡献均融在论文中作了明确懿说赘并表添了{奏

2、懑。磷究生签震：承重青蠡壹阕：爱。哆年歹是岁。目关于论文使用授权的说明本入完全了解中翔农监大学有关傈留、使篇学位论文的规定，鄱：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借闼，可以采用影印、缩印或扫攒等复制手段傺存、瓤

3、编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文鹣全部域部分痰容。(保密的学位论文在解密后成遵守此协议)研究生签名：琢雪青时间：2。。夕年，月刃日每舞签名：可莎万觚帆枷≥年r月芗怖日缡写方法英文名称8MEcDNAC能BD嚣PCDMF转馘SODTTlPTGmRNAPVP{￥瓤X—gaI缩潞词8一Me}ea》toethanolcomplementaryDNAcetyltrimethy}ammoniumbromidediethylpyrocarbonatedimefllylformamidedimethylSulphoxide1，4

4、一dithiothreitolsopropyl一8一D-thiogalactosidemessengerRNApolyvinylpyrrolidone镛s(hydroxymethy

5、)methylamino5-bromo·4chlom-3-indolyl-B—D-galactoside中文名称8一蕊基Z；醇互补DNA十六烷基兰矗基浚{七锻煮碳酸二己酯二攀基甲酝胺二擎萋耍撬二蕊苏糖黪凳薅基一t3-13．半黢辍嫠信使RNA聚苏烯毗嗡烷酮三魏早基氦纂擎靛5·演珥一氯-3-吲哚-B-D．半乳糖瞥撼要本实验敬新韪篪苹菜为研究材辩，采翊CTAB法成功的觚苹巢采实

6、璺提取了高质量的RNA。利朋MMLV反转录酶把总RNA中的mRNA反转录成cDNA，用特髯引物进{亍LD—PCR扩增合成颓链eDNA。然搿用CHROMASPtN--400Column对eDNA进行分级分离，去除小于500bp的eDNA片段。甩带有粘性末端敝链eDNA与xTriplEx2载体连接，利用x噬菌体包装蛋商对合成的双链cDNA避行体外包装。包装产物侵染E．coliXL—Blue后构建eDNA文库，最历进行文库的扩增。该eDNA文库的滴度为1。191×l矿，文库驰宽隆数为1．112×10”，扩增厢滴发为1．532×10“’，插入片段平均大小在1

7、kb左右，蓝白斑筛选证实其照缀率大于9s％。同时，由于反转最过程中采用附加序列的方法健全欧mRNA褥到反转录，所强得到的eDNA焐完整的，完企符合eDNA文库的要求。本实验成功构建了新红怒苹果果实eDNA文库。关键词：勰红星苹粜，RNA提敬，eDNA合成，eDNA文蓐2AbstractAhighqualityeDNAlibrao'ofggedstar'kingfruithasbeenconstructed．ThetotalRNAofapplefruitshasbeenextractedbyusingCTA8method．Thesinglestrand

8、eDNAwassynthesizedfrommRNAwithMMLVreversetranscriptase，thendoublestrandeDNAwassynthesizedbyusingPCR．DoublestrandeDNAsizefractionationwascompleted醅CHROMASPIN400column，sothelowmolecularweighteDNAfragmentsshorterthan500bpcouldberemovedout．eDNAwaspackagedusingtheXphagepackagingsyst

9、emafterbeingligatedtothebluntedXTrip{Ex2．TheeDNAlibraryhasbeenconstructedandamplifiedthroughtransduetingE．coli屁1-BlueTheconstructedcDNAlibraryhasthetiterof1，191Xi矿andtheclonenumberis1．112Xl。由．Whfietheaverageinsertsizesofthelibraryare1kbwiththerecombinationefficiencymorethan95％．

10、andthemnplifiedtiterofthelibraryis1，532X10”，Therefore，