errα在病毒感染中作用及其机制初步地研究

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1、摘要＼黜燃细胞的免疫应答可分为先天性免疫应答和获得性免疫应答，先天性免疫应答是机体抗感染免疫的第一道防线，在获得性免疫活化前，它就开始发挥抗感染的作用。先天性免疫应答途径的激活主要是通过模式识别受体(PattemIkcogmtionR∞eptors，PRRs)识别病原相关分子模式(Pa胁gell．AssociatedMolecularPattems，P√址佃s)。PRRs根据其结构特点主要包括：NOD样受体(NOD．1ikerec印tors，NLRs)、ToU样受体(Toll．1呔erec印tors，TLIb)和IuG．I样受体(RJG．I．1il【erreceptors，R

2、IfRs)等。瑚s主要包括细菌的细胞壁组分、鞭毛蛋白、脂多糖、非甲基化CpGs、病毒的遗传物质和细胞自身产生的损伤分子等。P砌b识别P—6山口后，发生构象改变并募集下游的接头蛋白，激活下游的一系列激酶，启动细胞内级联反应，进而激活#录因子NF．1(B(NuclearFactorl(B)和干扰素调控因子(№mIronR(鄹lato巧Facj．rS，时s)，最终激活宿主的免疫反应。转录因子NF．1出、Ⅱ心3及A_P．1(Activa_torprotein1)调控I型干扰素的表达在抗病毒先天性免疫途径中起到了极为重要的作用，然而，I型干扰素信号通路的过度激活会导致组织、器官损伤。因

3、此，精确调控I型干扰素表达，也是宿主先天性免疫信号通路的主要研究热点。本实验室前期工作中发现雌激素相关受体伍(Es仃ogenrelatedrec印toru，EⅪ沲)可能参与宿主先天性免疫信号通路的调控。EIm是第一个被发现的孤儿核受体，它是通过雌激素受体0【(Es仃ogenrec印tor，ERa)的DBD结构域低严谨性杂交发现的。研究显示ERRa的功能主要通过其转录因子活性，在PGClc【或PGClp共刺激因子的辅助下，调节能量代谢及线粒体氧化磷酸化。临床研究结果表明ERRa失调与肥胖、糖尿病及肿瘤等代谢性疾病密切相关。近期研究发现，ERR仪通过增强线粒体功能促进ROS的产生

4、，帮助宿主细胞清除胞内感染的李斯特单胞菌。过氧化物酶体增殖物活化受体(PP—埘)促进能量代谢，同时也有促炎作用；肝X受体(L烛)通过抑制Ⅱ江3活性，抑制删B的表达。提示我们核受体可能参与调控宿主先天性免疫应答。但是，目前尚未发现E砌h与宿主先天性免疫应答信号转导途径之间的相关性报道。本研究发现：1．病毒感染促进细胞内EI汰伐的表达：以293T、HeLa、A549和MEF细胞为研究模型，利用VSV病毒感染，通过免疫印迹的方法，发现病毒感染后细胞ERRa在病毒感染中的作用及其机制的初步研究内ERR0【的表达以时间依赖的方式显著增强；以DNA病毒HSV感染293T，通过免疫印迹的方

5、法，发现病毒感染后细胞内ERR0【的表达以时间依赖的方式显著增强。以上结果说明ERRa参与病毒感染过程。2．ERR仪抑制先天性免疫应答信号通路的激活：通过IFN．p荧光素酶报告基因实验，发现过表达Emm可以抑制polyI：C、视黄酸诱导基因1(Retinoicacid勘duciblegene1，ⅪG—I)、线粒体抗病毒蛋白(mitochon越alantiviralsi911alingprotein，MAVS)、TANK结合激酶1(B蝌K-bin曲19l血ase．1，TBKl)和Ⅱ

6、染，通过RT-PCR检测方法，发现XCT790增强了病毒诱导的州．B的激活并促进了干扰素下游P10、ISG56基因的转录水平。以上结果说明，EI汛Ⅸ抑制I型干扰素信号通路的激活。3．ERRc【通过抑制TBKl．Ⅱ心3复合物的形成抑制I型干扰素信号通路的激活：在293T细胞中共转染ERR伐和TBKl表达载体，通过免疫共沉淀和免疫印迹实验，发现外源EI汛c【和TBKl之间存在相互作用；构建GST_ERRc【原核表达载体，通过GsT-pulldown实验，发现ERR仅与TBKl之间存在体外相互作用：分离小鼠骨髓巨噬细胞，利用VSV病毒感染，通过免疫共沉淀和免疫印迹实验，发现EⅪ№和

7、TBKl之间的相互作用随病毒感染时间的增加，先变强后逐渐降低；在293T细胞中共转染Ⅱ强3、TBKl和EI汛c【真核表达载体，通过免疫共沉淀和免疫印迹实验，发现ERR0【可以显著降低Ⅱ江3与TBKl之间的相互作用：在293T细胞中过表达EI水Ⅸ，利用VSV病毒感染，通过免疫印迹实验，发现ERR0【过表达抑制病毒诱导的眦3磷酸化水平；分离小鼠骨髓巨噬细胞，采用EIm0【抑制剂XCT790或siI矾A处理，利用VSV病毒感染，通过免疫印迹实验，发现病毒诱导的Ⅱ心3磷酸化水平在ERRq缺失细胞中显著增强。以上