下调泛素表达对人肺癌细胞放射敏感性影响及作用机制地研究

《下调泛素表达对人肺癌细胞放射敏感性影响及作用机制地研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、II下调泛素表达对人肺癌细胞放射敏感性的影响及作用机制研究中文摘要中文摘要目的探讨泛素分子在非小细胞肺癌中的表达，转染抑制泛素基因表达的shRNA-UBB、UBC质粒联合X射线对人非小细胞肺癌A549和H1299细胞生长和放射敏感性的影响及机制研究，在动物体内验证下调泛素表达的致放射增敏作用。方法通过免疫组化法检测泛素在肺癌及癌旁组织中的差异表达，并通过体内、外实验研究下调泛素对非小细胞肺癌的放射敏感性的影响及其机制：（二）体外实验：1、设计沉默泛素基因表达的shRNA-UBB和shRNA-UBC，用RT-PCR及West

2、ernblot法验证shRNA的沉默效果；2、MTT法及克隆形成实验检测转染抑制泛素基因表达的shRNA-UBB，shRNA-UBC，shRNA-UBB/UBC（联合转染shRNA-UBB和shRNA-UBC）对肺癌A549和H1299细胞的增殖及放射敏感性的影响；3、流式细胞计数法测定下调泛素表达对人肺癌H1299细胞的凋亡和周期分布的影响；4、Western-blot法测定上述干预处理后细胞凋亡、周期、DNA损伤相关蛋白表达水平的改变；5、细胞免疫荧光法检测辐射诱导的细胞γH2AX清除能力的变化。（三）体内试验：1、裸

3、鼠皮下建立人非小细胞肺癌移植瘤模型，按实验要求分组。测量肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，计算各组的肿瘤生长抑制率；2、检测增殖指标Ki67表达水平的变化。结果泛素在非小细胞肺癌中的表达明显高于癌旁组织，成功设计并转染shRNA下调泛素的表达。体外实验结果：1、RT-PCR结果显示shRNA-UBB-4(shRNA-B4)及shRNA-UBC-2（shRNA-C2）的抑制泛素基因表达的效果比较明显，蛋白水平抑制率达76%，因此选择这两种shRNA质粒进行后续功能实验的研究；2、分别在A549和H1299细胞中转染shRNA-UB

4、B，shRNA-UBC及shRNA-UBB/UBC，MTT检测结果为shRNA-UBB/UBC能明显抑制H1299细胞的增殖（p<0.05），而分别转染shRNA-UBB，shRNA-UBC时其抑制作用不及联合转染组明显;在A549细胞中，shRNA-UBB/UBC能抑制其增殖（p<0.05）,但其细胞生长抑制率低于H1299（67.3%VS.32.8%,24h,32.9%VS.16.5%，48h）；3、克隆形成实验检测细胞放射敏感性结果提示：H1299细胞单纯照射组和照射联合shRNA-UBB/UBC组的平均致死剂量（D

5、0）分别为1.40和0.97Gy，准域剂量DqI中文摘要下调泛素表达对人肺癌细胞放射敏感性的影响及作用机制研究分别为1.99和1.42，shRNA-UBB/UBC对H1299细胞的放射增敏比（SER）为1.44，而对A549细胞的放射增敏比（SER）为1.05；4、进一步研究下调泛素表达联合X射线对H1299细胞凋亡的影响，结果表明6GyX射线联合下调泛素表达（shRNA-UBB/UBC）组细胞凋亡率明显增加，细胞凋亡率由8.79%增至30.44%（P<0.05）。基因组DNA凝胶电泳分析，泛素下调（shRNA-UBB/U

6、BC）加照射组与单纯X射线照射组比较，基因组DNA中180bp左右凋亡片段明显增多，与流式细胞仪检测结果一致，下调泛素表达促进辐射诱导的细胞凋亡；5、下调泛素表达处理后，6GyX射线诱导的H1299细胞γH2AX清除能力下降；6、联合转染shRNA-UBB/UBC可显著增加H1299细胞的G1期阻滞，联合X射线作用下，在相同照射剂量条件下，联合转染shRNA-UBB/UBC对H1299细胞的周期分布没有影响；7、Western-blot结果显示，转染shRNA-UBB/UBC联合X射线照射后能明显降低H1299细胞的抗凋亡

7、蛋白Bcl-2，p-AKT，cyclinD1及NF-κB的表达水平。NF-κB的抑制蛋白IκB磷酸化水平降低（IκB蛋白磷酸化后经泛素蛋白酶系统降解，而后NF-κB活化），从而转位入胞核内的NF-κB蛋白水平降低。体内实验结果：1、成功构建裸鼠的H1299细胞移植瘤模型，实验过程中，裸鼠的体重无明显变化；2、shRNA-UBB/UBC+IR组的H1299细胞裸鼠移植瘤的体积与单纯照射组相比显著减小，差异具有统计学意义（P<0.05）；与单纯照射组比较，shRNA-UBB+IR组、shRNA-UBC+IR组、shRNA-UB

8、B/UBC+IR组的肿瘤生长抑制率分别：(51.55±10.85)%,(70.26±5.66)%,(74.61±7.59)%,(79.31±6.48)%。结论泛素在非小细胞肺癌中高表达；转染shRNA-UBB，shRNA-UBC下调人非小细胞肺癌A549和H1299细胞后出现明显的细胞增殖抑制作用，其对