纤维素酶活力的测定

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1、生物化学实验报告题目：纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法）姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。二、实验原理：纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。三、实验试剂：1.3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10g3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500ml，升温溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000ml。存于棕色瓶中，

2、放置一周后使用。2.0.1摩尔pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。3.0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。4.标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。5.酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待测。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制）四、实验器材：1.比色管10支。2.722型分光光度计。3.滴管。4.水浴锅。5.移液枪。6.电炉。五、实验步骤：1.标准曲线的绘制：分别吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml的葡萄糖于5支3比色管中，均用蒸馏水稀释至1

3、ml，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3ml，在沸水浴中煮沸显色10分钟，冷却，加蒸馏水21ml，摇匀。以1ml蒸馏水代替糖作空白管，在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微g数为横坐标，绘出标准曲线。1.空白管的测定:取1ml酶液，沸水浴5分钟，冷却加3ml0.5%CMC，与样品管同时放入50度水浴30分钟。其它操作同样品管。2.样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3ml，酶液1ml，于50度水浴中糖化30分钟，取出，立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活，得糖化液，冷却加入3ml显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25ml，混匀，550nm测OD值。二、实验结果：在上述条件下，

4、1㎎酶每分钟催化纤维素水解生成葡萄糖微克数定为一个活力单位。纤维素酶活力单位＝N---酶液的稀释倍数30---糖化所用时间1---反应酶液ml数实验测得的数据记录如下：表1各比色管550nmOD值比色管123456空白样品1样品2样品3标准葡糖液/ml00.20.40.60.81.0--------葡萄糖/μg020040060080010000未知未知未知550nmOD值00.1090.2280.3510.4870.59400.4330.4310.431样品550nmOD值平均值==0.432。作出标准曲线：3图1葡萄糖溶液550nmOD值标准曲线通过标准曲线可求得样品中葡萄糖量为732μ

5、g，所以：纤维素酶活力单位＝=2.44×103u/mg所以每克固体酶的活力=2.44×103×103=2.44×106u一、注意事项：1.在测定OD值过程中，绘制标准曲线时要用1号葡萄糖标准液（葡萄糖浓度为0）调零，测定样品OD值时要用样品空白液调零。从实验原理上看，这样做的目的是：无论是标准液还是样品液，都要去除葡萄糖外的其他各种成分的对OD值的影响。得到的标准曲线经过坐标原点。2.用移液管或移液枪加各试剂时，不能将移液管或移液枪头混用。3