基于噬菌体展示技术副猪嗜血杆菌抗体文库的构建

《基于噬菌体展示技术副猪嗜血杆菌抗体文库的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、摘要mqlllllllqlllllllllMIIlUqlllllllllllJlllllIY2141556副猪嗜血杆菌是定居于猪的上呼吸道中机会性病原菌，在特定的条件下引发疾病。感染猪引起的疾病，称副猪嗜血杆菌病，也称为猪的革拉瑟氏病，以多发性浆液纤维性浆膜炎、关节炎、脑膜炎和心包炎为病理特征。近年来大规模爆发该病给各国各地区的养猪业带来了巨大的经济损失，而国内外防制该病多采用传统的全菌体疫苗和使用多品种大剂量抗生素。虽然在防制猪的革拉瑟氏病取得了一定的成效，但是，常常导致防制的失败。因此，本研究拟采用近年来出现的噬菌体抗体展示技术，建立副猪嗜血杆菌抗体的噬菌体展示文库，试图筛

2、选针对性强的适用的预防及治疗性抗体制剂，为制备针对副猪嗜血杆菌病的抗体开辟新途径。本研究的主要结果如下：1．提取经副猪嗜血杆菌灭活疫苗免疫后屠宰猪脾脏组织中总RNA，经Oligo(dT)15反转录后，用猪的IgG可变区轻重链特异性引物扩增可变区基因。扩增到12条可变区基因，包括H链基因的5条序列，K链基因的5条序列和入链基因的2条序列。2．将12条序列分别克隆到测序载体pMDl9．T上进行测序，测序结果与NCBI中猪的IgG的可变区序列比对，均属于猪的kG的可变区序列。通过IMGT数据库中VQuest软件比对分析可变区推导氨基酸的残基，划分为7区，分别为FRl、CDRl、FR2

3、、CDR2、FR3、CDR3和FR4。所有序列的CDR是可变的，尤其是CDR3。3．采用带有linker接头片段的引物，利用重叠延伸PCR组合了VH链和VL链的基因，组装成6条scFv。4．将6条scFv分别克隆到噬菌粒pC3C，用氯化钙法转化到大肠杆菌XLl一Blue，构建了重组子pC3C．scFv。经酶切鉴定，结果与预期结果一致，测序鉴定pC3C—scFv阳性重组子，与预期结果99％以上相同。以辅助噬菌体VCSMl3救援阳性重组子，建立了噬菌体抗体库。5．用IPTG诱导重组子pC3C．H2．2K1．1表达scFv，其表达产物的分子量大小约为30kDa。6．对重组子pC3C—

4、H2．2K1．1的噬菌体进行滴度的测定，其滴度为1．7×1012。II摘要关键词：副猪嗜血杆菌；抗体文库；分子构建；噬菌体展示技术；scFv的表达IIIABSTRACTHaemophilusparasuisisaopportunisticetiologicagentcolonizedcommonlyinupperrespiratorytractofhealthyconventionalpigs，andcausestheinfectionofHaemophilusparasuisinsomestressconditions，alsocalledas“Gl瓠ser’Sdisease

5、”，whichischaracterizedbyfibrinouspolyserositis，polyarthritis，meningitisandpericarditis．Inrecentdecade，infectionscausedbythisbacterialpathogenhaveledtogreateconomiclossesinthepigindustryworldwide．Vaccinesusedforpreventingtheinfectionsarewholecellinactivatedvaccineathomeandabroad，includingbiva

6、lentvaccineandpolyvalentvaccine．AlthoughthesevaccineshaveplayedanimportanteffectinpreventingfromtheinfectionscausedbyhomologousstrainsofHaemophilusparasuis，immunefailuresoftenoccureverywhere，perhapsduetOserotypedifferencebetweenthestrainsofvaccineisandinfections．Pigfarmershaveusedvariousanti

7、bioticsatlargedoses．SO-called“healthdrugprevention’’orpharmacotherapytoprotectbreakoutofdisease．Nevertheless，theetiologicagentispronetoinducingresistanceofantibiotics，andevenmultiresitance，thusleadingtofailureofdrugpreventionorpharmacotherapy．Inthi