相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术及其在生物医学领域的应用

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1、文章编号：相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术及其在生物医学领域的应用周前’，袁景和，周卫，朱建华，方晓红（四川大学物理科学与技术学院高能量密度物理与技术教育部重点实验室，四川成都；中国科学院化学研究所分子纳米结构与纳米技术重点实验室，北京}摘要：相干反斯托克斯拉曼散射〈）成像技术是一种具有高信号强度、高化学选择性•无需外源标记的显微成像新技术:本文在简介成像基本原理的基础上，综述了显微成像技术的发展、与其它技术相结合等研究新方向，以及在生物医学领域的应用进展,关键词：相干反斯托克斯拉曼散射；显微成像

2、;生物医学应用：表面增强效应收稿H期：基金项目：国家自然科学基金委重大仪器研制项目高分辨多功能化学成像系统资助作者简介：周前男汉族浙江人博士研究生通讯作者:朱建华男汉族山东人教授方晓红女汉族湖南人研究员中图分类号：；；文献标识码：显微成像技术的进步推动了现代生物医学研究的不断发展同时现代生物及医学技术的发展需求也使得人们对显微成像技术的要求不断提高光学成像技术具有非接触式测量对样品无损伤高时空分辨率和高探测灵敏度等特点成为普遍采用的显微成像技术其中荧光探针标记显微镜的采集灵敏度高商品化荧光标记物种类

3、多的优点使其在生物医学领域得到了广泛地应用特别在单分子定位成像和单分子追踪等领域荧光标记成像的方法发挥着重要作用但荧光标记可能干扰生物分子功能且荧光探针自身光致漂白导致成像探测时间短等问题使得荧光标记显微镜在生物医学应用存在局限性不同于荧光标记的方法基于探测样品分子固有振动频率的红外光谱和拉曼光谱显微成像技术有着无需对生物样品进行预先标记处理以分子固有特征振动能级产生的光谱信号作为成像对比度具有分子特征选择性等优点但分子振动谱信号通常情况下比荧光信号强度低得多使得其在探测灵敏度数据采集时间激光功率方

4、面有着比较大的限制极大地影响了其在活体组织和活细胞当中的应用doi•同样基于分子振动能级的相干反斯托克斯拉曼散射是一种三阶非线性光学过程其产生的受激共振信号强于自发拉曼散射ft具有一定的方向性使得信号的收集效率更高与此同时信号频率高于激发光频率可以避开单光子荧光背景的干扰利用光谱与传统共聚焦光学显微成像技术相结合而产生的显微成像技术可以通过检测样品分子特征振动光谱信号获取特定分子的空间分布和分子间相互作用信息上述这些优势使得显微成像技术在牛物和医学研究领域有着广泛的应用前景本文首先从显微成像技术的

5、原理出发比较了几种不同显微成像系统的优缺点然后介绍了显微成像技术的发展过程以及与其他技术的综合应用特别是与表面增强拉曼技术相结合的表面增强和针尖增强技术之后介绍了显微成像技术在生物陕学研究的进展和一些代表性的工作最后评述了成像技术发展需解决的挑战性问题及其应用前景1CARS显微成像的基本原理和CARS显微镜的基本结构为一个四波混频的非线性光学过程在泵浦光场E®斯托克斯光场E如和探针光场E‘0)相互作用下的样品分子会产生一个频率为333的反斯托克斯场E图为过程的能级图图分别表示共振信号非共振信号和泵浦

6、光作用下双光子共振信号产生的过程在大多数情况下泵浦光和探针光都来自于同一束激光则上述过程当屮信号强度正比于如下的极化强度pP=XEE其屮I为三阶极化率通常表示为以下Phasematchingcondition形式Af=一-3_3--6)-ir其中为待测分子振动能级特征频率r和r分别为拉曼谱线和双光子光电转换谱线的半高宽a和a分别是与拉曼散射截面和双光子吸收截面相关的两个常数由式可知三阶极化率的大小山三项确定第一项体现了与振动能级频率共振部分的贡献第二项则为独立于拉曼位移非共振部分的贡献第三项反映了

7、一个增强非共振部分的双光子共振过程过程还需要满足相位匹配条件1丨Electronicallyexcitedstatei53”匚v=0(A)Resonanlcontribution(B)Nonresonantcontribution(C)Two-plu)tonenhancednonresonantcontribution图过程的能级图Ik/kkk其中kk和&分别为泵浦光斯托克斯光和信号的波矢k是波矢失配量当相干距离1远远大于光场与待测分子作用距离丨时信号方能产生利用高数值孔径物镜的紧聚焦条件相位兀配条

8、件容易得到满足大大简化了系统结构和调试难度如图所示按照泵浦光斯托克斯光和信号采集光路位置的不同显微成像系统被分为三种基本结构分别是前向探测后向探测和逆向传播探测信号强度较大但探测光路在激发光路的前方不利于将激发光与信号分离并FL难以避免样品溶剂水所产牛的背景信号不利于提高信噪比可以有效地消除溶剂的背景噪声对小体积的样品具有比较高的灵敏度同时也方便与其他技术进行联用也提供了一种探测嵌入在非线性介质中亚微米物体的高灵敏度手段但其光路结构比较复杂泵浦光和斯托克斯光的对准比